纳洛酮对慢性酒精中毒大鼠学习记忆减退的影响及其神经机制的实验研究

摘要

背景与目的:嗜酒和酒精滥用已成为全球性的医学和社会问题。在我国,随着人们生活水平的提高,酒精滥用亦日趋严重。长期饮酒导致认知功能障碍,行为改变等严重的神经精神问题,而学习记忆障碍是长期饮酒后最普遍最持久和对人们健康生活影响最严重的问题之一。学习和记忆是动物和人赖以生存的重要脑功能之一,学习是神经元获取外界信息的的功能;记忆则是将获得的信息储存和读出的过程,两过程相互联系。学习和记忆过程受递质和神经肽的调节,如阿片肽、胆碱能神经递质、儿茶酚胺类神经递质、NMDA、GABA、NO、P物质、血管加压素、钙基因相关肽、神经营养因子等均可影响学习和/或记忆过程,它们直接或通过相互作用来影响学习和记忆的某环节或者某方面,从而参与对学习记忆的调节。
　　中枢神经系统内主要有三种内源性阿片肽(内啡肽、脑啡肽、强啡肽),它们分布广泛,其中以下丘脑、纹状体、海马和皮质等脑区含量较高。中枢神经系统内内源性阿片肽作为神经递质或神经调质,与其相应的受体相互作用(μ、δ和к),调节诸多大脑功能。
　　阿片类药物成瘾及脱毒的多年研究发现阿片系统也参与了学习记忆,其过程非常微妙、复杂。国内外大量的动物实验证明,中枢神经系统内的内源性阿片肽水平变化以及外源性给予阿片都会影响动物学习记忆的某个过程。酒精作用于中枢神经系统内的神经递质改变了内源性阿片肽尤其是β内啡肽的释放,改变了阿片肽合成、分泌及其与受体结合的特性,从而导致一系列认知及行为学改变。
　　纳洛酮(naloxone)作为一种非选择性阿片受体拮抗剂,能结合多种阿片受体起作用,并具有广泛的药理作用。慢性酒精摄入增加动物脑内β内啡肽的释放,提高垂体前叶β内啡肽的含量,增加伏隔核内的前强啡肽水平,而脑内阿片样物质增多会使大脑处于高代谢状态,并抑制了GABA中间神经元的活动,产生兴奋性神经毒性。β内啡肽具有神经阻滞剂的功能,抑制脑内DNA合成。纳洛酮能竞争性结合μ阿片受体,从而阻断β内啡肽的神经毒效应,还能抑制β内啡肽释放,增加DNA合成,调节核酸代谢。
　　基于以上理论和资料,纳洛酮改善长期酒精摄入所致学习记忆障碍与其改变阿片肽的释放及其阿片肽与受体的活动有关,本课题采用大鼠长期饮用酒精制作动物学习记忆障碍模型,对其机制作进一步探讨:纳洛酮是否改变脑区内阿片肽的水平,改变阿片与其受体的活动;对学习记忆的相关神经元结构有何影响,从而为纳洛酮改善酒精所致痴呆的临床运用提供理论依据,并进一步阐明阿片系统参与学习记忆过程的调节机制。
　　材料和方法:实验动物为3周龄雄性Sprague Dawley(SD)大鼠64只,随机分为4组(n=16), A慢性饮酒/生理盐水组、B慢性饮酒/纳洛酮组、C饮水/生理盐水组、D饮水/纳洛酮组,给A、B组大鼠自由饮用由含6％逐渐递增至15%(v/v)的乙醇水溶液8周建立慢性酒精中毒模型,同时用顶空气相色谱法测定大鼠在饮酒过程中不同时段血液中的酒精浓度。8周后, B组大鼠连续10天腹腔注射纳洛酮(1.0 mg/kg),A组腹腔注射等量生理盐水,对照组C、D也分别注射生理盐水和纳络酮;然后在四组中随机选择10只大鼠进行 Morris水迷宫训练观察隐匿、可见平台逃避潜伏期、搜索策略、空间探索实验。采用放射免疫法测定下丘脑、海马、纹状体和前额叶皮质内每克组织中β内啡肽(β-EP:βendorphin)、强啡肽A(Dyn A:dynorphin A)、甲脑啡肽(MENK:met-enkephalin)和亮脑啡肽(LENK:leu-enkaphalin)的含量。其余各组6只断头处死,采用 Nissl染色法进行海马CA1、CA3区锥体细胞计数,Golgi染色观察海马CA1、CA3区顶树突形态的改变。
　　结果:1.水迷宫成绩:
　　(1)在Morris水迷宫7个时段的隐匿平台训练中,有4个时段A组动物的逃避潜伏期较正常对照组长(P<0.01或P<0.05),其中纳洛酮治疗后B组比A组明显缩短(P<0.05)。
　　(2)探索实验中A、B饮酒组在目标象限游泳时间都明显短于正常对照组C(P<0.01或 P<0.05),而纳洛酮治疗后B组明显长于A组(P<0.05)。游泳路径的站台周边区域分布显示:四组采取了不同的搜索策略,A、B组游泳路径分别主要分布在远离站台的周边区域Ⅲ、Ⅱ(P<0.05),而正常对照组C和纳络酮对照组D游泳路径都主要分布在接近站台的周边区域Ⅰ(P<0.05),差异有显著性。游泳速度及其穿越原平台次数四组差异无显著性。
　　(3)可见平台学习中,四组动物的逃避潜伏期组间差异无显著性(P>0.05)。上述结果说明长期酒精摄入后引起大鼠空间学习记忆能力下降,而给予纳洛酮治疗后能改善动物受损害的学习记忆能力。各指标在 C、D对照组间(生理盐水和纳络酮处理组)差异均无显著性,说明纳洛酮对正常组大鼠的学习记忆能力无明显影响。
　　2.形态学检测:
　　(1)Nissl染色光镜下,饮酒组A的海马CA1、CA3锥体细胞数较正常对照组A明显减少(P<0.05和P<0.01),锥体细胞层次排列稀疏,细胞间隙明显增大;严重的出现细胞大面积缺失,大部分存活的细胞尼氏物质模糊不清或消失,其中CA3区细胞丢失程度较CA1区更为严重。
　　(2)Golgi染色显示:饮酒组A大鼠海马CA1、CA3区锥体细胞顶树突长度都明显短于正常对照组C(P<0.05和P<0.01),且顶树突直径明显大于正常对照组C(P<0.05和P<0.01)。纳络酮治疗组B,大鼠海马CA1、CA3区锥体细胞数增加;锥体细胞顶树突长度和直径均较单纯饮酒组A有所逆转,差异有显著性(P<0.05)。
　　3.四组大鼠各脑区内β-EP、Dyn A、MENK、LENK含量:大鼠长期酒精摄入后,A组的下丘脑、海马、纹状体和前额皮质内,其中有数个不同的脑区β-EP、MENK和LENK水平较正常对照组分别出现不同程度的升高,差异有显著性(P<0.05或P<0.01或P<0.001)。慢性酒精作用对Dyn A的影响却出现不同方向的改变,A组大鼠海马、纹状体和前额皮质内的Dyn A水平较正常对照组C出现下降,差异有显著性(P<0.01);而给予纳洛酮处理后,能完全逆转或部分逆转各脑区内β-EP、脑啡肽和Dyn A含量的改变,差异有显著性(P<0.05)。
　　结论:
　　1.长期酒精摄入后大鼠的空间记忆保持能力及空间定位的准确性都受损;纳洛酮能明显改善其损害作用,从而改善学习记忆。
　　2.酒精损害海马神经元的结构并减少其数量;纳洛酮对海马CA1、CA3区锥体细胞起保护效应。
　　3.慢性酒精作用改变了大鼠下丘脑、海马、纹状体和前额叶皮质脑区内的β-EP、Dyn A和脑啡肽的水平,慢性酒精作用损害学习记忆的机制可能是其影响了动物脑区内阿片肽的释放及其活动;非选择性阿片受体拮抗剂纳洛酮能部分逆转或完全逆转慢性酒精摄入后脑区内阿片肽水平的变化。

目录

目录

中文摘要

英文摘要

前言

材料和方法

1．材料

1．1实验对象

1．2实验药品：

1．3实验仪器

1．4主要试剂

2 方 法

2. 1 动物及分组：

2. 2 实验流程

2. 3 慢性酒精中毒模型的建立：

2．4 顶空气相色谱法测定血液中乙醇浓度（BEC）[10]:

2．5 给药：

2. 6 行为学测试

2. 7 大鼠脑组织中β内啡肽、强啡肽和脑啡肽的样本提取及含量测定

2. 8．形态学检测：

2. 9 统计学处理：

结果

1．建立慢性酒精中毒模型后各组动物血液中酒精浓度（BAC）：

2．纳络酮治疗对慢性酒精中毒大鼠Morris水迷宫成绩的影响

3．形态学检测结果

4．大鼠各脑区内阿片肽亚群含量变化结果

讨论

1．长期饮酒对大鼠空间学习记忆的影响

2．慢性酒精作用对大鼠海马形态学方面的影响

3．慢性酒精作用对内源性阿片肽水平的影响

4．阿片系统对学习记忆的影响

5．阿片系统参与酒精影响记忆相关因子的效应

6．纳洛酮治疗长期饮用酒精空间学习记忆减退的神经机制

结论

参考文献

慢性酒精作用对阿片系统的影响和学习与记忆的关系

缩写词汇表

致谢