兔肝辅酶Ⅱ依赖性视黄醛还原酶的分离纯化、性质鉴定及全长cDNA的克隆

摘要

维生素A类物质(retinoids)在哺乳动物众多的生理功能中起着重要的作用,这些物质体内稳态的失衡可能会导致疾病的发生。细胞内维生素A类物质的稳态受饮食、体内相关代谢酶等多方面的严格调控,但是相关酶类调控类维生素A代谢的机制到现在仍然没有完全阐明。
　　黄东阳教授(DY Huang and Y Ichikawa. Biochim Biophys Acta, Mar1997;1338(1):47-59)曾报道从兔肝细胞质溶胶纯化化了一个亚基分子量为34kDa、表观分子量为144kDa的辅酶 II依赖性的视黄醇脱氢/视黄醛还原酶(NRDR)。Genbank中登陆号为AB045133的cDNA被认为是NRDR的编码基因,它被注释为化物酶体蛋白并执行辅酶II依赖性的视黄醇脱氢或者视黄醛还原的功能。进一步分析发现Genbank中cDNA序列推导出来的蛋白的分子量约为27.4kDa,与纯化的NRDR蛋白有些差异,而且他们的N端序列并不完全一致。另外,我们发现和兔NRDR基因同源的小鼠和人的基因在相同的读码框架内有两个起始密码。兔NRDR基因是不是也应该又类似的结构?对于究竟哪个是天然蛋白真正的起始点的问题其他的一些相关研究的学者也还存在争论。由此我们推断最大可能是天然生理状态的NRDR蛋白可能是经过了有趣的翻译后修饰、加工的产物;另一种很小的可能性是NRDR的编码基因和前述的AB045133序列不同。
　　我们先运用 RACE(cDNA末端快速扩增法)方法成功的获得了全长的目的cDNA。通过序列的分析我们发现在同一个读码框架内它的5’末端也有两个起始密码。我们发现视黄醛还原活性存在于兔肝匀浆分级离心得到的的细胞质溶胶组分当中而不存在于含有过氧化物酶体的细胞器组分。随后通过连续的层析,包括离子交换层析、疏水层析、亲和层析和分子筛层析步骤,我们得到了高纯度的有功能的天然蛋白。SDS-PAGE分析显示该蛋白的表观分子量为28kDa;质谱精确测定确定其分子量为27.4kDa;进一步的分子筛层析确定其分子量为63kDa。运用N端测序、肽指纹图谱以及串连质谱的手段,我们确认该蛋白就是由AB045133基因编码。另外,初步的功能分析发现NRDR蛋白能够催化环境污染物9,10菲醌。

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引言

材料与方法

1材料

1.1动物组织来源

1.2主要试剂

1.3 主要仪器

2 方法

2.1 NRDR全长cDNA的克隆

2.2 全长cDNA的验证

2.3 蛋白含量的测定

2.4 样本中酶活性的测定

2.5 酶活性的计算

2.6 蛋白质的不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

2.7 肝细胞质溶胶的制备

2.8 柱层析纯化目的蛋白

2.9 分子量的测定

2.10 目的蛋白的鉴定

2.11 目的蛋白对9,10菲醌的作用

结果和讨论

1 全长cDNA的克隆

2 兔肝中目的蛋白的纯化

3 目的蛋白分子量的测定

3.1 SDS-PAGE确定表观分子量

3.2 分子筛层析法测蛋白分子量

3.3 质谱测定分子量

3.4 小结

4 目的蛋白的鉴定

4.1 PMF

4.2 串连质谱

4.3 N-端测序

4.4小结

5 目的蛋白对9,10菲醌的作用

6 讨论

结论

参考文献

致谢