蛋白酶激活受体在A549细胞的表达及其诱导趋化因子释放的研究

摘要

哮喘是一种具有可逆性气道阻塞、支气管高反应性、炎症以及遗传特异性的疾病,其确切发病机制尚不清楚。众所周知,变态反应性疾病与过敏原的反复接触有密切关系。虽然哮喘与变态反应性疾病的确切关系还不十分明确。但作为首先接触吸入性抗原的呼吸道上皮细胞,在哮喘与变态反应性疾病中有重要作用,呼吸道上皮细胞能够释放许多与哮喘和变态反应这两种炎症性疾病密切相关的介质和细胞因子,如单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、白细胞介素(IL)-1、IL-6、IL-8、GM-CSF、巨噬细胞炎症蛋白(MIP)、RANTES和嗜酸性细胞趋化因子(eotaxin)等。这些细胞因子通过募集、激活炎症性细胞而参与炎症过程。
　　丝氨酸蛋白酶在气道疾病中的作用,特别是类胰蛋白酶、凝血酶和弹性蛋白酶在哮喘的发生和发展中的潜在作用日益受到人们的关注。研究发现,不仅丝氨酸蛋白酶在哮喘过程中过度分泌,而且它们在气道炎症介质和细胞因子的合成和分泌中起着重要作用。但是,丝氨酸蛋白酶在呼吸道上皮中如何发挥作用,其机制尚不清楚。有报导认为,气道中的趋化因子IL-8和MCP-1在哮喘中的分泌增加,因此,我们利用A549细胞—一种人腺癌II型肺泡上皮细胞系来研究类胰蛋白酶、胰蛋白酶、凝血酶和弹性蛋白酶对肺上皮细胞IL-8和MCP-1分泌和基因表达的影响。
　　蛋白酶激活受体(protease-activated receptors, PARs)已经被证明是丝氨酸蛋白酶的受体。PARs属G蛋白耦联受体家族,是具有七次跨膜结构的受体。丝氨酸蛋白酶可以酶切PARs的N末端,暴露含有系锁配体的新的N末端,新的N末端作为系锁配体可自我激活PARs。在目前发现的四种PARs中,PAR-1是凝血酶和胰蛋白酶的受体;PAR-2是类胰蛋白酶、胰蛋白酶和弹性蛋白酶的受体;PAR-3和PAR-4也是凝血酶的受体。PARs分布在多种组织细胞上,PARs的激活能够引起不同的细胞分泌各种细胞因子。PARs的激活能引起人肥大细胞组胺的释放;诱导气道上皮细胞分泌 IL-6;成纤维细胞分泌IL-1;人口腔上皮细胞分泌IL-8。本实验研究四种PARs的激活对A549细胞IL-8和MCP-1释放的影响。既然A549细胞上的PARs在丝氨酸蛋白酶的作用中起关键作用,因此,我们对A549细胞PAR-1、PAR-2、PAR-3和PAR-4的表达进行研究。
　　方法:
　　(1) A549细胞PARs表达的鉴定:采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术、流式细胞仪和免疫荧光细胞染色分析技术分析肺上皮细胞系A549细胞PAR-1、PAR-2、PAR-3和PAR-4的表达情况。
　　(2)上皮细胞的激发实验:细胞换无血清培养液培养12-16 h后,加入各种浓度的凝血酶(0.01–10 U/ml,1 U/ml=6.7 nM)、胰蛋白酶(1–300 ng/ml,1μg/ml=42 nM)、类胰蛋白酶(0.125–2μg/ml,1μg/ml=7.4 nM)、弹性蛋白酶(0.01–0.6μg/ml,1μg/ml=34 nM)和它们相应的抑制剂;加入PARs-AP或它们的反激动肽(0.1-100μM,PAR-1-AP浓度为0.1-300μM);分别刺激细胞2 h、8 h和16 h后,收集细胞上清液,离心后分装,置-80℃冰箱中冻存。细胞上清液中 IL-8和MCP-1的浓度用相应的ELISA试剂盒检测。
　　(3)A549细胞IL-8和MCP-1的mRNA的表达:用实时荧光定量PCR方法研究PARs激活后A549细胞IL-8和MCP-1的mRNA的表达情况。(4)PAR-2激活对A549肺上皮细胞[Ca2+]i的影响:应用Fluo-3/AM荧光标记技术和激光扫描共聚焦显微镜检测PAR-2激活后A549细胞内的[Ca2+]i水平。
　　结果:
　　(1)利用 RT-PCR、流式细胞仪和免疫荧光细胞染色分析技术检测到了四种PARs在肺上皮细胞A549上的表达。
　　(2)上皮细胞激发实验显示,凝血酶、类胰蛋白酶、弹性蛋白酶和胰蛋白酶与A549细胞相互作用16 h后,分别诱导A549细胞IL-8的释放增加8、4.3、4.4和5.1倍;诱导 A549细胞MCP-1的释放分别增加6.5、1.8、1.6和3.1倍。凝血酶、弹性蛋白酶和胰蛋白酶所诱导的IL-8和MCP-1释放可以被其相应的抑制剂所抑制。PAR-1、PAR-2和PAR-4的激动肽分别诱导细胞IL-8分泌增加15.6、6.6和3.5倍;PAR-1、PAR-2激动肽分别诱导细胞MCP-1的分泌增加15和12.7倍。
　　(3)实时荧光定量PCR研究显示,丝氨酸蛋白酶及PAR-1和PAR-2激动肽可以上调IL-8和MCP-1的mRNA的表达。
　　(4)激光扫描共聚焦显微镜检测显示,胰蛋白酶、SLIGKV、tc-LIGRLO均能引发A549细胞内的[Ca2+]i增加,平均荧光强度分别比加入试剂前增加92％、47%和130%。大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)(一种常用的胰蛋白酶抑制剂)和α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)可以抑制胰蛋白酶诱导的细胞内[Ca2+]i的增加。
　　结论:
　　丝氨酸蛋白酶可能通过PARs激活诱导A549细胞IL-8和MCP-1释放增加,因而可能在人类与IL-8和MCP-1相关的呼吸道炎症性疾病中起作用。PAR-2的酶解激活导致磷酸肌醇通路的活化以及胞内钙的增加,引起细胞的活化和细胞因子的释放。

目录

中文摘要

英文摘要

第一部分肺上皮细胞系PARs表达的研究

材 料 和 方 法

一、 材料与主要试剂：

二、 主要仪器：

三、实验方法：

结果

1 A549细胞表达PARs mRNA

2 细胞仪检测肺上皮细胞PARs的表达

讨论

第二部分肺上皮细胞PARs激活的实验研究

材 料 和 方 法

一、 材料与主要试剂：

二、 主要仪器：

三、实验方法：

结果

1 凝血酶对A549细胞IL-8和MCP-1释放的影响

2 胰蛋白酶对A549细胞IL-8和MCP-1释放的影响

3 类胰蛋白酶对A549细胞IL-8和MCP-1释放的影响

4 弹性蛋白酶对A549细胞IL-8和MCP-1释放的影响

5 PARs激动肽及其反肽对A549细胞IL-8和MCP-1释放的影响

第三部分实时荧光定量PCR检测趋化因子基因在肺上皮细胞的表达

材 料 和 方 法

一、 主要试剂：

二、 主要仪器：

三、 实验方法和步骤：

结果

第四部分

材 料 和 方 法

一、 主要试剂：

二、 主要仪器：

三、 实验方法和步骤：

结果

1 PAR-2激动剂诱发A549细胞[Ca2+]i增加

2胰蛋白酶及其抑制剂对A549细胞[Ca2+]i的影响

讨论

结论

参考文献

综述1

综述2

致谢

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