蛋白酶活化受体-2激活剂在诱导人脐静脉内皮细胞释放炎症因子中的作用

摘要

位于血液与组织之间的血管内皮细胞(以下简称内皮细胞)不仅是血管内外物质交换的屏障,而且被认为是多种生理和病理生理过程的积极参与者。在炎症过程中,内皮细胞的主要作用表现为介导炎症细胞(如嗜酸性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞)从血液循环迁移至炎症组织,释放多种炎症介质(如IL-1、IL-8、INF-α、MCP-1)、调节血管的通透性和参与血管新生等。
　　PAR-2是蛋白酶活化受体(proteinase-activated receptors, PARs)家族的成员之一。在炎症反应中,PAR-2参与调控血管内皮细胞的多种功能。如:PAR-2能够调节内皮细胞的屏障功能、增加炎症细胞对血管内皮的黏附、诱导视网膜血管的新生、刺激组织因子的表达。此外,TNF-α和内毒素能够放大PAR-2激活肽SLIGKV诱导的IL-6产生。尽管PAR-2涉及血管内皮细胞的多种生理和病理生理作用,但是对胰蛋白酶(trypsin, EC3.4.21.4)诱导内皮细胞的炎症因子释放所知不多。内皮细胞表达PAR-2和胰蛋白酶,表明内皮细胞表面的PAR-2能够直接与胰蛋白酶相互作用。为此,我们推测胰蛋白酶可能诱导内皮细胞释放炎症因子,以调节其自身或周围细胞的功能。
　　本研究用0.1％ I型胶原酶分离人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)、培养体系为含内皮细胞生长添加物endothelial cell growth supplement(12.5μg/ml)和肝素(100μg/ml)的20%FBS-M199培养液,用CD105和CD31(platelet-endothelial cell adhesion molecule-1,PECAM-1)鉴定分离、培养HUVECs的纯度,采用RT-PCR和流式细胞术检测HUVECs的PAR-2 mRNA和蛋白质水平表达。用胰蛋白酶和其他PAR-2激活剂诱导HUVECs表达炎症因子。抗体芯片和ELISA检测诱导的HUVECs培养上清中的炎症细胞因子水平。
　　结果表明,本研究分离、培养的HUVECs纯度约95%。HUVECs在mRNA和蛋白质水平表达PAR-2。抗体芯片检测显示1μg/ml胰蛋白酶诱导释放32种炎症因子,而100μM SLIGKV-NH2诱导释放16种炎症因子。在SLIGKV-NH2诱导释放的16种炎症因子中,15种炎症因子也被胰蛋白酶诱导产生。在芯片结果中,胰蛋白酶和SLIGKV-NH2均显著诱导IL-1α、IL-8、 IL-10和IL-12释放,因此这些细胞因子被进一步研究。诱导细胞16 h后,胰蛋白酶能够显著刺激HUVECs释放IL-1α、IL-10、IL-12和IL-8(P均<0.05)。这些细胞因子的升高水平分别约为HUVECs基础释放水平的4.8、4.3、4.1和1.8倍。10μM和100μM SLIGKV-NH2及10μM tc-LIGRLO-NH2也能够诱导IL-8水平升高(P均<0.05)。胰蛋白酶抑制剂(大豆蛋白酶抑制剂,α1-抗胰蛋白酶)或PAR-2抑制肽FSLLRY-NH2均能够显著抑制胰蛋白酶诱导的IL-1α, IL-10、IL-12和IL-8释放(P均<0.05)。相关性分析表明,SLIGKV-NH2和胰蛋白酶诱导培养HUVECs8 h和16 h后,IL-8水平之间的相关性显著(P<0.05)。
　　总之,胰蛋白酶能够诱导内皮细胞释放多种炎症细胞因子,胰蛋白酶的作用很可能通过激活PAR-2途径。这表明胰蛋白酶和内皮细胞PAR-2相关机制参与人类炎症性疾病的发生、发展。

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缩略词表

1 前言

1.1 血管内皮细胞

1.2 蛋白酶激活受体-2

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

2.3 统计学分析

3 结果

3.1 HUVECs形态观察

3.2 HUVECs的CD105、CD31和PARs表达

3.3 各种激活剂和抑制剂对HUVECs形态的影响

3.4 胰蛋白酶和SLIGKV-NH2诱导HUVECs释放炎症因子

3.5 胰蛋白酶诱导HUVECs释放IL-1α、IL-10和IL-12

3.6 胰蛋白酶和PAR-2激活肽诱导HUVECs释放IL-8

4 讨论

4.1 HUVECs培养与鉴定

4.2 蛋白酶与炎症

4.3 内皮细胞PAR-2与炎症因子的释放

4.4 PAR-2相关的内皮细胞源性细胞因子与过敏性炎症

5 结论

参考文献