己烯雌酚对小鼠睾丸引带组织中AR、ERα、Acta1和PCNA mRNA表达的影响

摘要

目的：流行病学发现，近半个世纪以来，人类隐睾等雄性生殖系统畸形的发生率日趋增加，且与胎儿期母体内分泌干扰物(Eds)暴露有关。但其确切作用机制依然很不清楚。新近研究发现，雄性生殖系统中普遍存在雌激素受体（ER）的表达，Eds可能直接通过ER对雄性生殖器官产生不利影响,但也有研究显示Erα基因敲除小鼠睾丸大多不能正常下降，提示一定剂量雌激素可能是睾丸引带正常发育所必须的。本研究采用公认的代表性Eds己烯雌酚（DES）作用于孕期母鼠，检测不同剂量暴露对新生小鼠睾丸引带雄激素受体（AR）、雌激素受体α（Erα）、增殖细胞核抗原（PCNA）和肌动蛋白α1（Acta1)mRNA表达的影响,以探讨不同剂量Eds对睾丸引带的发育和功能的影响及其可能的作用机理。
　　 方法：SPF级8~10周龄雌性昆明小鼠140 只，随机分为7 组，每组20 只，组别为：正常组、对照组、实验组1 、实验组2 、实验组3 、实验组4 、实验组5 。实验组1、2、3、4、5分别给予DES0.02 μg/kg ·d 、DES 0.1 μg/kg ·d 、DES 0.5 μg/kg ·d 、DES 10 μg/kg ·d，DES 50μg/kg ·d，DES以二甲基亚砜（DMSO）为溶剂；对照组仅给予DMSO；正常组不给任何药物。每天下午6 时，按雌雄比例2:1 合笼，次日早晨8时检查雌鼠有无出现阴栓（vaginal plug），以出现阴栓作为受孕标志，发现阴栓当天定为妊娠第0 天，记为GD0（gestation day，GD）。雌鼠受孕后即单独饲养于一鼠笼中。GD9 至GD17 上午8时皮下注射给药，每次每只小鼠所用的DES 均溶于0.2ml DMSO后溶于NS中。仔鼠出生后第一天，每窝雄性仔鼠＜5 只者予淘汰，保留仔鼠中每剂量组随机挑选6窝，每窝随机挑选5 只雄性仔鼠，脱颈椎处死仔鼠，显微解剖收获得睾丸引带。用Trizol法提取总RNA,琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法鉴定RNA 完整性及纯度。Dnase处理RNA样本，然后行逆转录法合成第一链cDNA 。行普通PCR 法鉴定睾丸引带中存在AR 、Erα 、PCNA和Acta1基因mRNA 表达，运用TaqMan探针技术行实时荧光定量PCR，检测不同剂量DES染毒后AR 、Erα 、PCNA和Acta1 mRNA表达量的变化。
　　 结果：⑴正常新生昆明小鼠睾丸引带中存在Erα 、AR 、PCNA及Acta1 mRNA的表达。⑵胚胎期不同剂量DES染毒对新生小鼠睾丸引带ERαmRNA表达的影响不同。低剂量组(0.02 、0.1 μg/kg ·d）中ERαmRNA 表达量快速上升（P<0.01），DES 到达0.5 μg/kg ·d后ERαmRNA 表达量上升不明显，在高剂量组中出现一定的减少（P<0.05）。⑶胚胎期不同剂量DES染毒对新生小鼠睾丸引带AR mRNA 的表达存在抑制作用，低剂量组(0.02 、0.1 μg/kg ·d）中AR mRNA 表达量轻微下降（P<0.05），DES 到达0.5 μg/kg.d后AR mRNA 表达量快速下降（P<0.01）。⑷胚胎期不同剂量DES染毒对新生小鼠睾丸引带Acta1 mRNA表达的影响不同。在低剂量组(0.1 μg/kg ·d）中Acta1 mRNA 表达量轻微上升（P<0.05），DES到达0.5 μg/kg ·d后Acta1 mRNA 表达量快速下降（P <0.01）。⑸胚胎期不同剂量DES染毒对新生小鼠睾丸引带PCNA mRNA 表达的影响不同。在低剂量组(0.1 μg/kg ·d）中PCNA mRNA 表达量轻微上升（P<0.05）；DES到达0.5 μg/kg ·d后AR mRNA表达量快速下降（P <0.01）。⑹经相关性分析，不同剂量DES影响下AR、PCNA及Acta1 mRNA 表达的改变有高度相关性（P<0.01）,且为正相关；ERαmRNA 表达与AR 、PCNA及Acta1 mRNA表达不存在统计学相关性。
　　 结论：①正常新生昆明小鼠睾丸引带中存在Erα、AR、PCNA及Acta1mRNA的表达。②胚胎期不同剂量DES 染毒对小鼠睾丸引带中Erα、AR、PCNA及Acta1mRNA表达的影响不同。适当剂量雌激素对睾丸引带发育及功能可能是有益的，也有可能是一种代偿反应，有必要进一步研究不同剂量下相应蛋白的表达情况。高剂量DES对睾丸引带存在毒性抑制作用，明显抑制AR 、PCNA及Acta1 mRNA表达。③不同剂量DES影响下AR 、PCNA 及Acta1 mRNA 表达的改变有明显正相关；ErαmRNA表达与AR 、PCNA 及Acta1 mRNA表达不存在统计学相关性。这提示雄激素与睾丸引带正常发育及功能的关系比雌激素更为密切。④本实验中采用的微量RNA提取方法可以比较有效的从睾丸引带组织中提取总RNA 。