己烯雌酚对小鼠睾丸引带组织中胰岛素样因子3受体LGR8的影响

摘要

目的:
　　近年来许多研究表明环境雌激素(EEs)可以造成男性生殖系统分化和发育异常,且大多数与睾丸发育、下降不全相关,而睾丸引带与睾丸发育、下降关系密切。在胚胎发育过程中,睾丸由高位腹腔下降到阴囊分为两个阶段,经腹下降阶段和腹股沟阴囊阶段。睾丸经腹下降阶段主要由INSL3控制。敲除INSL3或它的受体LGR8基因都会使小鼠发生隐睾。EEs是否通过影响INSL3的受体LGR8干扰INSL3-LGR8的信号转导尚不清楚。本研究利用经典的EEs己烯雌酚(DES)直接作用于孕期昆明小鼠,通过观察胎鼠和幼鼠睾丸引带的形态结构变化,并检测LGR8蛋白和mRNA的表达,来探讨外源性雌激素(EEs)影响睾丸引带发育的可能途径。
　　材料和方法:
　　SPF级8～10周龄雌性昆明小鼠120只随机分成6组(每组20只):正常组、对照组、实验组1、实验组2、实验组3、实验组4。实验组1-4分别给予DES0.1、1.0、10.0、及100.0μg.kg-1.d-1。DES以二甲基亚砜(DMSO)和生理盐水为溶剂。对照组仅给予DMSO和生理盐水;正常组不给任何药物。雌雄小鼠按常规合笼交配,以出现阴栓作为受孕标志。发现阴栓当天定为胎龄第0天,记为E0(Embryonicday)。在E9～E17上午8～9时皮下注射给药,每组所用的DES均溶于等量的DMSO及生理盐水中,以保证每次每只小鼠每千克体重所给予的DMSO和生理盐水相同。E18脱颈椎处死孕鼠,迅速取出胎鼠,切取其下腹部经10％福尔马林固定24小时,然后给予水洗、梯度酒精脱水、二甲苯透明,石蜡包埋。幼鼠组待其自然分娩,小鼠出生第1天记为PND0(Postnatalday)。于PND20处死雄性小鼠,解剖获得睾丸引带,予固定、石蜡包埋。对包埋组织块作4μm厚冠状位连续切片并进行常规HE染色和特殊的免疫组织化学研究,观察睾丸引带结构的变化,检测各组睾丸引带组织中胰岛素样因子3受体(LGR8)的表达。应用3倍手术放大镜和显微器械解剖获得E18胎鼠睾丸引带,肉眼解剖获得PND20小鼠睾丸引带。用TRIzol法提取引带组织总RNA,琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法鉴定RNA完整性及纯度。DNase处理RNA样本,然后逆转录法合成第一链cDNA。行PCR法鉴定睾丸引带中存在LGR8的表达。PCR产物测序,并取一定量行琼脂糖凝胶电泳,利用凝胶分析系统对扩增产物条带进行扫描,将凝胶电泳图像输入凝胶电泳图像分析软件(BandScan5.0)进行表达强度分析。TRIzol法提取总RNA的同时提取总蛋白,WesternBlot检测各组睾丸引带LGR8蛋白表达。
　　结果:
　　1.解剖可见实验组胎鼠睾丸在腹腔的位置明显较正常组高,实验组幼鼠隐睾发生率高。光镜观察可见胎鼠正常组、对照组睾丸引带发育良好,中间的间叶组织和外周的肌源细胞之间分界清楚;实验组尤其是高剂量组可见睾丸引带发育不良,间叶组织和肌源细胞之间无明显分界,组织结构紊乱。幼鼠睾丸引带可见肌源细胞呈纤维状,间叶组织未见明显细胞结构。正常组和实验组未见明显不同。
　　2.免疫组织化学染色可见LGR8阳性细胞呈棕黄色或棕褐色,表达于睾丸引带细胞膜,正常组、对照组和实验组均有表达,相同发育阶段的正常组和对照组阳性表达较强,实验组阳性表达较弱,且随DES剂量的增加阳性表达减弱。胎鼠(E18)各实验组与正常组相比有统计学意义(P<0.05),幼鼠(PND20)DES1μg、10μg、100μg组与正常组相比有统计学意义(P<0.05)。同剂量组幼鼠(PND20)比胎鼠(E18)LGR8阳性表达强(P<0.05)。
　　3.正常组、对照组和实验组小鼠睾丸引带中均存在LGR8mRNA的表达。相同发育阶段的正常组和对照组无统计学差异,DES高剂量(10μg、100μg)组与正常组和对照组相比LGR8mRNA表达增加(P<0.05)。各相同剂量组的胎鼠LGR8mRNA与幼鼠相比未见差别(P>0.05)。实验组PCR产物测序未见明显突变。
　　4.WesternBlot没有检测到LGR8特异性蛋白表达。
　　结论:
　　1.孕期DES暴露可导致子代小鼠睾丸引带形态异常、组织结构紊乱,且与剂量关系密切。
　　2.LGR8表达于不同发育阶段的睾丸引带组织,亚细胞定位于细胞膜。孕期DES暴露可使子代小鼠睾丸引带组织中LGR8蛋白表达水平降低,相同剂量的DES对胎鼠LGR8蛋白表达的抑制更明显。随着子代小鼠的生长发育,LGR8蛋白表达有一定的增加。
　　3.DES可上调睾丸引带组织中LGR8mRNA的表达,但未发现基因突变。
　　4.DES对睾丸引带组织LGR8蛋白和mRNA的不同影响,提示DES对LGR8蛋白表达的影响可能发生在转录后。DES有可能通过干扰LGR8蛋白表达影响睾丸引带的发育,这种干扰作用可随生长发育获得一定程度的纠正。

目录

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声明

中文摘要

英文摘要

主要缩略语中英文对照表

目录

第一章 前 言

第二章 技术路线

第三章 材料与方法

1材料

2 方法

第四章 结 果

1.形态观察

2 免疫组化（IHC）

3 RT-PCR

4 免疫印迹法（Western Blot）检测小鼠睾丸引带组织LGR8的表达

第五章 讨 论

1 睾丸下降与睾丸引带

2 环境雌激素与生殖系统发育异常

3. INSL3与LGR8信号系统

4.环境雌激素 LGR8与

第六章 结 论

参考文献

附 录

附1：附图

附录2：综述

参考文献

附录3：研究生期间发表文章

参考文献

致谢

个 人 简 历