长链非编码RNA MEG3作用蛋白筛选与鉴定以及CDK3真核系列表达载体的构建

摘要

第一部分
　　目的：建立一种体内研究RNA-蛋白相互作用的新方法，筛选鉴定lncRNA MEG3相互作用蛋白。方法：利用噬菌体MS2衣壳蛋白可与MS2bs RNA特异性结合的特点，设计特异性引物，构建pcDNA3.0-Flag-2×MS2和pcDNA3.0-12×MS2bs表达载体，以及表达非编码RNA MEG3的表达载体pcDNA3.0-MEG3V1-12×MS2bs；共转染细胞，进行RNA免疫沉淀，所得RNA进行实时定量PCR分析验证；所得蛋白进行蛋白质谱分析和Western blot验证。结果：成功构建了 pcDNA3.0-Flag-2× MS2、 pcDNA3.0-12× MS2bs和pcDNA3.0-MEG3V1-12×MS2bs表达载体。实时定量PCR结果表明，与对照相比，RNA免疫沉淀能明显富集MEG3V1非编码RNA分子；蛋白质谱和Western blot结果表明，与对照相比，RNA免疫沉淀能明显富集MEG3V1相互作用蛋白。结论：成功构建了一种体内研究RNA-蛋白质相互作用的表达载体，建立了一种体内研究RNA-蛋白质相互作用的新方法，为RNA-蛋白相互作用研究提供了新的技术手段，成功筛选出了MEG3V1的两个相互作用蛋白，ILF3和PABPC3。
　　第二部分
　　目的：构建系列细胞周期蛋白依赖激酶3（CDK3）在哺乳动物细胞的表达载体，并在真核细胞中进行初步的表达。方法：从食管癌细胞中提取总RNA，逆转录PCR扩增CDK3编码区，然后将PCR产物克隆到T载体；扩增后的CDK3片段分别克隆入pcDNA3、pcDNA4、pNTAP和pEGFP等四种哺乳动物表达载体；最后，将获得的表达载体转染小鼠成纤维细胞NIH3T3进行初步的CDK3表达分析。结果：PCR扩增获得约900bp的目的片段，经T载体克隆和DNA序列分析显示重组片段是人CDK3基因序列，全长915bp；CDK3片段分别克隆入pcDNA3、pcDNA4、pNTAP和pEGFP载体，获得相应表达载体；构建的表达载体可以在真核细胞中表达出CDK3蛋白。结论：成功构建了CDK3的系列哺乳动物细胞表达载体，并在NIH3T3细胞中得到表达。

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第一部分 长链非编码RNA MEG3作用蛋白筛选与鉴定

1.1 绪论

1.2 材料与方法

1.3 结果

1.4讨论

1.5小结

第二部分 CDK3真核系列表达载体的构建

2.1 绪论

2.2 材料与方法

2.3 结果

2.4 讨论

2.5 小结

总 结

参考文献

附 录

致谢

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