氧化性低密度脂蛋白和胆固醇对HepG2细胞脂肪积累及SIRT1-LXR信号通路的影响

摘要

目的：
　　探讨氧化性低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,oxLDL)和胆固醇(Cholesterol,CH)对肝细胞内脂肪积累以及对SIRT1-LXR和NF-κB-TNFα信号通路的影响,深入探讨脂肪肝等代谢综合症形成的分子机制。
　　研究表明,脂肪肝发病过程中不仅涉及脂代谢紊乱、脂肪积累、同时还伴随着炎症反应,多种因素参与了该病的发病过程,它是一种复杂的代谢性疾病。SIRT1参与多种信号通路调控,具有预防高脂饮食所造成的脂肪肝等代谢性疾病、延长寿命的作用,该信号路的调控过程涉及细胞程序性死亡,细胞分化以及能量代谢等;肝细胞X受体(liver X-activated receptors,LXR)是核受体超家族成员,主要调控胆固醇吸收、转运、代谢等过程,维持体内甾醇和脂代谢和糖代谢平衡,同时参与炎症反应的调节。ATP结合盒转运蛋G1(ATP-binding cassette transporter G1,ABCG1)是LXRα的靶分子,参与胆固醇转运、调节脂代谢,参与凋亡细胞清除和有毒物质去除等。另外有报道,在脂肪肝等代谢综合症发生过程中,炎症反应诱导的转录因子(如NF-κB)及肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNFα)等多种炎症因子明显增高;而SIRT1过表达或被激活,NF-κB的乙酰化程度便会受到抑制,从而会抑制炎症反应信号通路、减轻细胞损伤、改善糖代谢。
　　基于以上背景,我们推测:在高脂或/和高oxLDL、CH环境,肝细胞中正常脂代谢受到影响,SIRT1-LXR信号通路可能受到抑制而NF-κB-TNFα炎症信号通路被激活,从而造成脂肪肝的形成。
　　方法：
　　实验细胞分为7组:高糖对照组、氧化性低密度脂蛋白(oxLDL)组、高脂(high-fat,HF)组、HF+oxLDL组、高胆固醇组(CH)、能量限制(calorie restriction,CR)+CH组、CR组。其中除CR+CH和CR组细胞培养于低糖DMEM培养基中,其他各组细胞均培养于高糖DMEM培养基中。另外,HF组培养基中加入0.1mmol/l的软脂酸钠;oxLDL组培养基中加入80μg/ml的oxLDL;HF+oxLDL组培养基中加入80μg/ml的oxLDL和0.1mM的软脂酸钠;CH组培养基中添加0.75g/L胆固醇;CR+CH组培养基加入0.75g/L胆固醇。细胞培养24h后用四氮唑蓝比色分析法(MTT)检测细胞活力,确定CH有效作用浓度;培养48h后用油红O染色法定性拍照观察和通过测定OD值定量检测细胞内脂肪积累,并采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测SIRT1、LXRα及其靶基因ABCG1和NF-κB,TNFαmRNA相对表达水平。
　　定量油红O染色法检测细胞内脂肪积累用spss15.0进行协方差分析(analysis of covariance);绘图和mRNA定量分析用Graph Pad Prism 5,组间比较用one-way ANOVA(and nonparametric)方法(Test name为Newman-Keuls,即SNK法)。P<0.05表示具有统计学意义。
　　结果：
　　MTT检测结果显示,CH浓度从0g/L上升到0.125g/L,细胞活力显著下降,CH浓度在0.125-1.0g/L时,细胞活力基本保持稳定,浓度高于1.0g/L细胞活力进一步迅速下降。与对照组比,oxLDL组、CH组、HF组、HF+oxLDL组和HF+CH组细胞内脂肪含量均增加(P<0.05),CR组细胞中脂肪含量降低(P<0.05),HF+CH组要比HF组高(P<0.05);而oxLDL组和HF+oxLDL组脂肪含量比较接近,差异也不具有统计学意义,并且它们分别低于HF组(均P<0.05);CH组和HF+CH组脂肪含量较接近,差异不具有统计学意义。RT-PCR结果显示,与对照组比,CH组和CH+CR组SIRT1、LXRα和ABCG1mRNA表达均增加(均P<0.05);oxLDL组SIRT1、LXRα和ABCG1三种分子mRNA表达均增加,其中SIRT1和LXRα差异具有统计学意义(P<0.05);HF+CH组三种分子mRNA表达均降低,其中SIRT1和LXRα差异具有统计学意义(P<0.05);HF组SIRT1和LXRα与对照比差异无统计学意义,而ABCG1显著低于对照(P<0.05);HF+oxLDL组LXRα和ABCG1表达均显著降低(均P<0.05),而SIRT1与对照组比差异无统计学意义。NF-κB,TNFα分子mRNA表达结果前后差异较大,结果不具有统计学意义。
　　结论：
　　oxLDL、CH和HF均可使脂肪在肝细胞中堆积,其中CH使细胞中脂肪积累较多。在HF中加入oxLDL或CH,肝细胞中脂肪可能会进一步增加。oxLDL、CH对三种mRNA影响具有相似性,它们都能够使SIRT1、LXRα和ABCG1三种分子表达增加,而oxLDL+HF、CH+HF可以抑制这三种分子mRNA的表达,并且oxLDL+HF、CH+HF对三种分子mRNA的抑制作用可能要大于单独HF。因此,oxLDL或CH能够促进肝细胞内脂积累,在高血脂环境下它们可能通过抑制SIRT1-LXRα通路加剧脂肪肝的形成,通过干预该信号通路有可能达到预防和治疗脂肪肝的目的。而oxLDL或CH是否能激活NF-κB-TNFα通路有待进一步试验验证。

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第一章 前言

1.1研究背景

1.2 本项研究基金来源情况

1.3 本项研究内容及意义

第二章 材料方法

2.1 实验材料

2.2 技术路线

2.3 试验方法

2.4 统计学处理与绘图

第三章 结果与分析

3.1 CH对细胞活力影响

3.2 oxLDL、CH对细胞内脂肪积累影响

3.3 CR条件下CH对SIRT1-LXR通路mRNA表达影响

3.4 oxLDL、CH对SIRT1-LXR 通路mRNA表达影响

3.5 oxLDL、CH对NF-κB, TNFαmRNA表达影响

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

综述

1 脂肪肝简介

2 SIRT1-LXR信号通路与脂肪肝

3总结

参考文献

致谢

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