维氏气单胞菌SmpB蛋白对双组份系统毒力传感蛋白BvgS启动子调控的研究

摘要

研究表明SmpB蛋白参与细胞众多生理过程的调节，如机体新陈代谢、脂多糖生物合成、脂肪酸代谢途径、致病菌入侵宿主等，其参与的调控作用对于细菌蛋白质合成质量控制、致病菌中毒力系统调控、维持机体正常生长及发育等过程具有关键作用。
　　本论文以致病菌维氏气单胞菌作为实验模式菌，对其SmpB蛋白调节双组份系统毒力传感蛋白BvgS启动子现象与机制进行探索，取得了以下结果：
　　1、使用增强型绿色荧光蛋白(eGFP)作为报告基因，与BvgS启动子融合构建载体 pDH114，同时构建表达维氏气单胞菌 SmpB的质粒，将其共转化到△tmRNA△SmpB E.coli Feldon中，通过测定Flu/OD600值的强弱来表征BvgS表达量的变化。结果表明维氏气单胞菌SmpB蛋白对BvgS启动子具有正调控作用。
　　2、进一步利用维氏气单胞菌SmpB蛋白截短突变体△N34和△C30以及定点突变体G11S12→A11A12，T14I15→A14A15，F26I27→A26A27，E32A33G34→A32A33A34， G133K134→A133A134，D138K139R140→A138A139A140，K152→P152，探究影响其功能的关键区域与关键位点。结果发现N端区域对于SmpB发挥功能很关键，C端区域可以影响SmpB功能；G11S12及E32A33G34位点对于SmpB发挥功能比较重要。
　　3、通过构建 pET-28a(+)-SmpB-His6表达载体、IPTG诱导表达、Ni-琼脂糖凝胶6FF纯化、Western Blot检测，获得纯化的SmpB蛋白，与BvgS启动子进行琼脂糖凝胶迁移实验。结果显示SmpB/BvgS启动子存在滞后现象，表明SmpB蛋白与BvgS启动子可以特异性的相互作用。
　　4、通过基因敲除获得维氏气单胞菌△SmpB和△tmRNA突变株，利用实时定量 PCR技术分别对E.coli Feldon模式菌中BvgS启动子下 eGFP转录本及△SmpB和△tmRNA突变株中BvgS基因转录本进行检测。结果表明在细菌生长稳定时期，SmpB蛋白通过影响 BvgS启动子转录水平来调控下游基因表达， tmRNA对BvgS转录水平影响不大。
　　综上所述，本论文初步阐明了维氏气单胞菌SmpB可以正调控双组份系统毒力传感蛋白BvgS启动子现象与机制，对发掘细菌性疾病治疗靶点，研发新型抗生素提供了新的方向和思路。

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缩略语

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第1章 前言

1.1 维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)简介

1.2 细菌中SmpB蛋白研究进展

1.3 细菌双组份系统研究进展

1.4 本课题主要研究内容与意义

第2章 维氏气单胞菌C4的鉴定

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 结果与分析

2.4讨论

第3章 维氏气单胞菌SmpB蛋白对BvgS启动子具有正调控作用

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

第4章 SmpB蛋白与BvgS启动子序列结合作用的探索

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论

第5章 SmpB调控BvgS启动子转录水平

5.1 实验材料

5.2 实验方法

5.3 结果与分析

5.4 结果与讨论

总结与展望

参考文献

致谢

发表论文及所获奖励情况