噬菌体展示技术筛选骨肉瘤细胞UMR-106特异性多肽及骨肉瘤模型构建的研究

摘要

【背景与目的】骨肉瘤是一种危害人类健康的恶性肿瘤。儿童恶性肿瘤中它的死亡率极高。目前临床工作中用于骨肉瘤诊断的影像学方法包括X线、CT、MRI及骨扫描等，但这些方法存在各种原因的限制。光声成像是近年来迅速发展起来的新技术，由于它的方便，非侵入性，无辐射，使动物组织成像领域的应用具有广阔的前景。鉴于纳米分子影像探针具有强大的可调控性和靶向性，使其可在分子水平与特定器官或组织作用，作为特异的影像对比增强剂与光声层析成像联合应用从而可能实现对骨肉瘤进行早期特异性的检测。虽然光声分子成像探针的合成技术日趋成熟，但具体的分子探针的发现是关键点。噬菌体展示技术已经日益完善，它通过将基因的表达产物与亲和的筛选结合，然后选用适当的靶蛋白可将目的蛋白或多肽筛选出来。鉴于此，本研究有望率先通过噬菌体展示技术发现大鼠骨肉瘤细胞UMR106特异性的多肽，并将其应用于光声分子影像探针研制，从而探索出可早期特异性检测骨肉瘤的高分辨率光声重建影像，为临床早期诊断骨肉瘤开辟一条新途径，具有重要的意义。
　　【材料与方法】采用噬菌体随机七肽库与大鼠骨肉瘤细胞系UMR1063轮全细胞筛选；从经过3轮筛选后的噬菌体中随机挑取30个单克隆，利用ELISA及免疫细胞化学从噬菌体水平进行初步鉴定；阳性噬菌体单克隆被扩增后，提取其质粒进行测序；采用化学的方法人工合成多肽并局部标记绿色荧光素异硫氰酸（FITC）；采用免疫荧光技术鉴对4条多肽的特异性及亲和力进行鉴定；利用大鼠骨肉瘤细胞系UMR106构建裸鼠皮下骨肉瘤模型并利用MRI检测，肿瘤组织HE染色。
　　【结果】利用噬菌体展示七肽库与UMR106细胞进行3轮筛选后，与靶细胞特异性结合的噬菌体富集了1500倍左右。ELISA结果表明，P/N＞2.1阳性克隆25个，阳性率为83.3％。免疫细胞化学结果显示阳性噬菌体克隆phage-24对UMR106细胞中具有明显的特异性及亲和力。25个阳性噬菌体被扩增后，提取质粒DNA测序。测序结果表明，25个阳性噬菌体单克隆插入8个不同的序列的外源肽序列，我们把这些序列，分别命名为PT1-PT8。细胞免疫荧光显示PT6、PT7较其他多肽与大鼠骨肉瘤UMR106细胞的荧光更强。成功构建裸鼠早期的骨肉瘤模型并获得MR影像资料，组织病理学显示为骨肉瘤。
　　【结论】利用噬菌体展示技术成功筛得大鼠骨肉瘤细胞UMR-106的特异性多肽，该多肽对UMR106细胞具有高特异性及亲和力，从而为进一步制作特异性的光声分子影像探针提供实验依据。利用大鼠骨肉瘤细胞UMR106成功构建早期的骨肉瘤模型。综上，本实验研究为骨肉瘤早期的特异性诊断提供研究基础，对临床早期诊断骨肉瘤开辟一条新途径具有重要的意义。

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第一章 前言

第二章 大鼠骨肉瘤细胞特异性结合多肽噬菌体的筛选

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三章 大鼠骨肉瘤特异性结合多肽噬菌体的初步鉴定

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第四章 大鼠骨肉瘤特异性结合多肽噬菌体的测序

1 材料

2 方法

3 结果

4讨论

第五章 大鼠骨肉瘤特异性结合多肽的细胞特异性鉴定

1 材料

2、方法

3、结果

4、讨论

第六章 骨肉瘤动物模型的构建及MRI成像

1、材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第七章 结论与创新

参考文献

攻读学位期间发表论文情况

致谢

个人简历