相对低剂量己烯雌酚对小鼠睾丸引带细胞PKC/PKA通路的影响

摘要

目的：
　　目前大量研究资料证实外源性雌激素（EEs）与雄性生殖系统发育异常（畸形）密切相关，其具体影响及作用机理尚不明确。既往大多研究集中在对雄性生殖系统的核心器官睾丸的研究上，对与睾丸发育及下降密切相关的睾丸引带（gubernaculum testis）的研究甚少。睾丸引带对睾丸的下降发育过程起着引导、牵引，以及固定等作用。既往研究发现己烯雌酚（DES），一种经典的EEs导致小鼠睾丸引带组织的形态结构及细胞的增殖和收缩功能异常，并发现DES作用于睾丸引带细胞引起[Ca2+]i瞬时变化，提示可能与细胞钙通道信号通路有关。本实验针对PLC酶抑制剂U-73122预作用下，相对低剂量DES对小鼠睾丸引带细胞[Ca2+]i和CREB蛋白磷酸化水平的影响，探讨PKC/PKA信号通路在相对低剂量DES影响小鼠睾丸引带细胞中的作用，以进一步了解DES影响睾丸引带细胞增殖性和收缩功能的作用机理，或有助于揭示EEs影响睾丸下降发育，甚至影响泌尿生殖系统发育的可能机理。
　　方法：
　　将培养的传代小鼠睾丸引带细胞随机分为空白对照组（0.01％PBS，v/v）、溶剂对照组（0.01%DMSO组，v/v）、U-73122实验组1-6（U-73122终浓度分别为0.1、0.25、0.5、1、5和10μmol/L）、DES组（1.5×10-8 mol/L DES）和U-73122+DES组（1μmol/L U-73122预先作用细胞10 min后再加入1.5×10-8 mol/L DES）共10组。分别采用共聚焦显微镜[Ca2+]i测定法、CCK-8分析法及Western Blot方法检测PLC酶抑制剂U-73122对小鼠睾丸引带细胞生长状态和细胞[Ca2+]i的影响以及PLC酶抑制剂U-73122干预后相对低剂量DES对小鼠睾丸引带细胞增殖性、[Ca2+]i和CREB磷酸化蛋白（P-CREB）表达的影响。
　　结果：
　　1.1μmol/L及低于此浓度的U-73122作用于睾丸引带细胞，小鼠睾丸引带细胞形态和生长状态正常。U-73122浓度≥5μmol/L时引带细胞出现大部分死亡。U-73122各组加药瞬间小鼠睾丸引带细胞内游离钙离子的荧光强度变化率[(F0-Fmin)/F0]为12.58%、18.72%、38.96%、55.81%、63.59%、95.17%，与溶剂对照组相比，差异有统计学意义（P<0.05）。
　　2.DES可影响睾丸引带细胞的增殖性，并存在时间-效应关系（r=0.9193）。与同时间段DES组相比较，U-73122+DES组OD值明显下降，差异具有统计学意义（P<0.05）。
　　3.DES组加药瞬间细胞内游离钙离子的荧光强度变化率[(Fmax-F0)/F0]为143.32%，与溶剂对照组相比较，差别有统计学意义（P<0.05）。U-73122+DES组的荧光强度变化率为15.57%，与DES组相比较，差别有统计学意义（P<0.05）。
　　4.DES组能在3 h内不同程度诱导细胞p-CREB表达增加，与溶剂对照组相比较，差异有统计学意义（P<0.05）。与同时间段DES组相比较，U-73122+DES组（除30min外）p-CREB的表达均明显降低，差别具有统计学意义（P<0.05）。
　　结论：
　　1.PLC酶抑制剂U-73122影响小鼠睾丸引带细胞[Ca2+]i水平，且存在剂量--效应关系。1μmol/L U-73122对睾丸引带细胞正常生长无明显影响。采用1μmol/L U-73122探讨DES对睾丸引带细胞中PKC/PKA通路的影响。
　　2.PLC酶抑制剂U-73122可抑制相对低剂量DES促进对小鼠睾丸引带细胞[Ca2+]i升高的作用。
　　3.PLC酶抑制剂U-73122可抑制相对低剂量DES对小鼠睾丸引带细胞的增殖促进作用，并抑制DES所诱导的P-CREB的表达增加。综上，相对低剂量DES影响小鼠睾丸引带细胞的快速非基因效应至少部分通过了PKC/PKA细胞信号通路介导。

目录

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英文摘要

主要缩略语中英文对照表

目录

第一章 前 言

第二章 技术路线

第三章 材料和方法

1. 材料

2. 方法

第四章 结果

1. 原代细胞培养及PLC酶抑制剂U-73122对小鼠睾丸引带细胞生长状态和细胞[Ca2+]i的影响

2. PLC酶抑制剂U-73122干预后，相对低剂量DES对小鼠睾丸引带细胞增殖性的影响

3. PLC酶抑制剂U-73122干预后，相对低剂量DES对小鼠睾丸引带细胞[Ca2+]i的影响

4. PLC酶抑制剂 U-73122 干预后，相对低剂量DES对小鼠睾丸引带细胞CREB磷酸化蛋白表达的影响

第五章 讨 论

1. 环境低剂量EEs对生殖系统的影响

2. EEs在雄性生殖系统的快速非基因效应

3. U-73122对睾丸引带细胞的影响

4. PKC/PKA信号通路在相对低剂量DES影响小鼠睾丸引带细胞中的作用

5.总结和展望

第六章 结论

参考文献

附录：综述

致谢

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