异欧前胡素和内皮素-1对于体外培养人表皮黑素细胞黑素合成的调节作用

摘要

[目的]：
　　一些色素代谢紊乱性疾病，如紫外线 B(UVB)引起的色素沉着、老年斑、咖啡斑、皮肤纤维瘤，均发现有内皮素-1（Endothelin-1，ET-1）因子表达的上调。ET-1在表皮中由角质形成细胞产生，作为一种有丝分裂原，作用于黑素细胞的内皮素B受体（endothelin B receptor，ETBR），可以通过细胞内的PKC/MAPK和TYK/MAPK信号级联途径，协同调控黑素细胞的增殖和黑素产生。
　　在治疗色素障碍性疾病的中药中，白芷是较为常用的一种中药，已知白芷具有很高的药用价值和广泛的药理作用，如镇痛、抗菌、抗肿瘤等。目前对其药效学和药动学有一定研究，但其药物对人类皮肤的药理作用机制不是特别明确。异欧前胡素（Isoimperatorin）是白芷的主要活性成分之一。本研究旨在应用探索异欧前胡素和内皮素-1对于体外培养人表皮黑素细胞黑素合成的调节作用，并探索异欧前胡素对于黑素细胞黑素代谢的作用机理，为以异欧前胡素为主要成分的中药及中成药的开发和临床应用提供实验依据。
　　[方法]：
　　建立体外培养人表皮黑素细胞体系。通过MTT法选择异欧前胡素合适的作用浓度，黑素细胞经纯化培养后，随机分为6组：A组(空白对照组）、B组（Isoimperatorin25μM组）、C组（Isoimperatorin50μM组）、D组（Isoimperatorin25μM+10 nM ET-1组）、E组（Isoimperatorin50μM+10 nM ET-1组）、F组（10 nM ET-1组），各组黑素细胞按相应条件作用和培养48h后，通过倒置显微镜观察细胞的形态学变化；采用MTT法、CCK-8法测定异欧前胡素对黑素细胞活力的影响，利用酪氨酸酶催化氧化3,4-二羟基苯丙氨酸(L-Dopa)速率法体外测定酪氨酸酶活性；NaOH裂解法测定黑素含量；制备透射电镜样本，并通过透射电镜观察异欧前胡素对黑素细胞超微结构的影响；应用蛋白印迹法检测黑素细胞ETBR、酪氨酸酶蛋白（Tyrosinase，TYR）、酪氨酸酶相关蛋白1（Tyrosinase related protein1，TYRP1）、Rab27a蛋白含量的变化；实时定量PCR检测黑素细胞TYR在基因水平表达的变化；免疫荧光显微镜技术检测异欧前胡素对黑素细胞ETBR、TYR蛋白表达的影响。应用基因芯片技术检测比较A组(空白对照组）、B组（Isoimperatorin25μM组）的基因表达谱的差异。
　　[结果]：
　　1.异欧前胡素和ET-1可影响人表皮黑素细胞的形态，与A组比较，D组、E组黑素细胞树突向两极拉长；D组与B组比较、E组与C组比较，D组、E组黑素细胞胞体变大。
　　2. MTT法、CCK-8法检测细胞活力，结果表明，异欧前胡素对实验处理组（B、C、D、E）各组黑素细胞的细胞活力都呈剂量依赖性抑制。
　　3.人表皮黑素细胞黑素含量测定表明，异欧前胡素对实验处理组（B、C、D、E、F）各组黑素细胞黑素合成有抑制作用，其中异欧前胡素对D组和E组黑素细胞黑素合成抑制作用尤为明显，说明异欧前胡素和内皮素-1调节黑素细胞黑素合成有抑制作用并呈剂量依赖性效应。
　　4.经检测酪氨酸酶活性：异欧前胡素对实验处理组（B、C、D、E、F）各组黑素细胞酪氨酸酶活性呈抑制作用并呈剂量依赖性，其中D组和E组黑素细胞酪氨酸酶活性抑制作用更明显。
　　5.透射电镜结果显示，A组人表皮黑素细胞在透射电镜下黑素细胞胞浆内有较多黑化的黑素体靠近细胞膜分布。D组人表皮黑素细胞在透射电镜中黑素细胞胞浆内黑化的黑素体部分靠近细胞膜分布，部分靠近核膜周围分布，表明异欧前胡素和ET-1协同调节人表皮黑素细胞黑素体的转运。
　　6. Western blot检测体外原代培养的各组人表皮黑素细胞中ETBR蛋白、TYR蛋白、TYRP1蛋白、Rab27a蛋白，结果表明，与A组相比，B组、C组、D组、E组黑素细胞ETBR蛋白表达降低； B组、C组、E组黑素细胞的TYR蛋白表达降低，D组黑素细胞的TYR蛋白表达增加； B组、C组、E组黑素细胞的TYRP1蛋白表达增加，D组黑素细胞的TYRP1蛋白表达降低； B组、C组、D组、E组黑素细胞的Rab27a蛋白表达增加。
　　7.免疫荧光显微镜观察结果：体外原代培养的黑素细胞ETBR蛋白免疫荧光检测，A、B、C、D、E、F各组黑素细胞ETBR蛋白荧光强度平均光密度值分别是85.39％、44.55%、34.54%、37.09%、46.90%、151.09%，与A组相比，B组、C组、D组、E组黑素细胞的ETBR蛋白表达降低。黑素细胞TYR蛋白免疫荧光检测，A、B、C、D、E、F各组黑素细胞TYR蛋白荧光强度平均光密度值分别是79.46%、71.41%、62.63%、78.76%、57.44%、93.43%，与A组相比，B组、C组、D组、E组黑素细胞TYR蛋白表达降低。
　　8.基因芯片表达谱检测并分析比较正常组和异欧前胡素25μM组黑素细胞基因表达差异倍数，变化最显著的有13个基因，最明显上调的基因是FUT7、FAM126B、KRT6A、SSUH2、SYN2、RNF186、C4A|LOC100293534|C4B、ACTG2和MAFK，最明显下调的基因是 ADSL、CHCHD10、GRN、UQCRC1。这些差异基因主要功能范畴包括了核苷酸结合、ATP结合、蛋白质活性二聚体、转录活性调节、己糖代谢过程、单糖的代谢过程、糖蛋白生物合成的过程、糖蛋白的代谢过程、细胞增殖调节、磷酸盐代谢过程、磷代谢过程、磷酸化修饰、有机物质反应、大分子复杂装配、蛋白质复杂的装配、蛋白质寡聚化；进一步的分析表明有显著变化的通路包括有氨酰生物合成，急性髓性白血病，缬氨酸和亮氨酸、异亮氨酸的生物合成，溶酶体，细胞内吞，FcγR介导的吞噬作用等。结果提示异欧前胡素影响黑素细胞的多种生物过程。
　　9.实时荧光定量PCR检测黑素细胞的TYR mRNA的CT值，A、B、C、D、E、F各组分别是100.00%、75.40%、73.36%、107.69%、64.65%、103.40%。与A组相比，B组、C组、E组黑素细胞TYR mRNA表达降低，呈剂量依赖性抑制效应，D组黑素细胞TYR mRNA表达增加。
　　[结论]：
　　1．50μM浓度以下的异欧前胡素对黑素细胞没有明显的毒性，黑素细胞生长状态良好，但可引起黑素细胞胞体和树状突起的形态学变化。
　　2．异欧前胡素和ET-1协同抑制的黑素细胞黑素合成，主要是通过抑制黑素细胞 TYR的活性起作用，这与ETBR蛋白、TYR mRNA、TYR蛋白、TYRP1蛋白表达相关。
　　3．异欧前胡素对人表皮黑素细胞的作用还与核苷酸结合、ATP结合、蛋白质活性二聚体、转录活性调节、己糖代谢过程、单糖的代谢过程、糖蛋白生物合成的过程、糖蛋白的代谢过程、细胞增殖调节、磷酸盐代谢过程、磷代谢过程、磷酸化修饰、有机物质反应、大分子复杂装配、蛋白质复杂的装配、蛋白质寡聚化、细胞周期调控等过程有联系，提示异欧前胡素参与了黑素细胞的多种生物化学反应过程。

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第一章 前言

第二章 实验材料

2.1 实验药物

2.2 实验标本来源

2.3 主要试剂

2.4 实验技术路线：

第三章 实验方法

3.1 正常人表皮黑素细胞的体外培养体系的建立

3.2 异欧前胡素和内皮素-1协同调节人表皮黑素细胞活力的测定

3.3 异欧前胡素和内皮素-1 协同调节人表皮黑素细胞黑素合成作用的检测

3.4 异欧前胡素和内皮素-1 协同调节人表皮黑素细胞酪氨酸酶活性影响的检测

3.5 人表皮黑素细胞透射电镜样本制备及超微结构观察

3.6 免疫荧光技术观察异欧前胡素和内皮素-1 协同调节人表皮黑素细胞酪氨酸酶蛋白，内皮素B受体的表达的影响

3.7 Human OneArray Plus基因芯片检测黑素细胞基因表达谱

3.8 荧光定量PCR检测人表皮黑素细胞TYR mRNA和GAPDH mRNA的表达

3.9 Western blot免疫印迹法检测人表皮黑素细胞蛋白表达

3.10 数据分析

第四章 实验结果

4.1 正常人表皮黑素细胞的体外培养体系建立

4.2 异欧前胡素浓度梯度及其作用

4.3 异欧前胡素和内皮素-1协同调节人表皮黑素细胞形态学的影响

4.4 异欧前胡素和内皮素-1协同调节人表皮黑素细胞活力的测定

4.5 异欧前胡素和内皮素-1协同调节人表皮黑素细胞黑素含量的测定

4.6 异欧前胡素和内皮素-1协同调节人表皮黑素细胞酪氨酸酶活性影响的检测

4.7 电镜观察异欧前胡素和内皮素-1协同调节人表皮黑素细胞的超微结构的作用

4.8 Western blot检测异欧前胡素和内皮素-1协同调节人表皮黑素细胞的ETBR、TYR、TYRP1、Rab27a蛋白的作用

4.9 免疫荧光技术观察异欧前胡素和内皮素-1协同调节人表皮黑素细胞ETBR、TYR的表达的影响

4.10 Human OneArray Plus基因芯片检测黑素细胞基因表达谱

4.11 荧光定量PCR检测异欧前胡素和内皮素-1协同调节黑素细胞的TYR mRNA和GAPDH mRNA的表达

第五章 讨 论

一 . 异欧前胡素和内皮素-1协同调节人表皮黑素细胞的作用

二 .基因芯片检测异欧前胡素对黑素细胞中特征性基因的作用

第六章 结论

结论：

创新

不足:

展望：

参考文献

附录一：试剂配制

附录二：英文缩写词

附录三：统计学分析

附录四：BCA法测定蛋白浓度标准曲线的绘制

附录五：黑素细胞样品RNA质量检测

附录六：PCR扩增曲线和溶解曲线

综述: Rab27在细胞分泌颗粒转运过程的作用机制

个人简历

研究生期间发表论文

致谢