去甲肾上腺素对体外培养的人表皮黑素细胞增殖、黑素合成及凋亡的影响

摘要

研究背景:
　　 白癜风是一种常见的色素障碍性皮肤病，其发病率在全世界人群中约为0.5-2％，平均发病年龄20岁左右，无明显性别差异。该疾病虽不影响患者的生理健康，但却给患者的身心带来巨大负担。目前，该疾病的病因尚不明确，发病机制有四种假说：自身免疫、神经体液因素、自身细胞毒性(氧化应激造成易感性增强)和遗传性的黑素细胞自毁学说。这些机制都没有被最终证实，推测可能不同类型自癜风发病机制不同或是各种发病机制不是单独作用，而是几种因素共同起作用。
　　 白癜风的神经起源学说由美国学者Aaron.B Lerner于1959年提出，该学说认为在白癜风中皮肤外周神经末稍释放某种物质可抑制黑素合成，对黑素细胞有毒性作用，支持该学说的证据有：①伴有神经损伤的白癜风患者在神经支配区域不发生或较少发生白斑。②节段性白癜风的存在。③皮损局部出汗增加和血管收缩，提示肾上腺素能神经活性增强。④在青蛙局部注射褪黑素、乙酰胆碱、去甲肾上腺素、肾上腺素能使其色素细胞褪色。
　　 黑素细胞和神经细胞均起源于神经嵴，且两类细胞均是利用同一种物质(即酪氨酸)作为原料合成终产物，分别是黑色素和儿茶酚胺，儿茶酚胺在结构上跟黑素合成途径中的某些产物很相近。目前，亦有较多关于白癜风神经精神学说方面的文献报道，Cucchi等应用高效液相色谱法和电化学探测器测量正常人和不同时期非节段型白癜风患者血浆，发现所有患者血浆去甲肾上腺素(NE)、肾上腺素(E)、去甲变肾上腺素(NMN)、高香草酸(H-VA)和5-羟基吲哚乙酸(5-HIAA)的水平都显著高于对照组，且活动期患者的NE、NMN、3-甲氧-4-羟基苯乙二醇(MHPG)和HVA高于稳定期水平。另外，皮损中α和β肾上腺素能受体的反应性在节段型患者中显著提高，而血液中儿茶酚胺和肾上腺素能受体的浓度没有改变，这提示交感神经功能障碍对节段型白癜风发病起一定作用。
　　 去甲肾上腺素是交感神经系统的主要神经递质，去甲肾上腺素由神经末梢和角质形成细胞分泌到表皮微环境中，通过肾上腺素各类受体与黑素细胞作用。那么，这种神经递质对黑素细胞的生物学活性有何直接作用呢?本实验拟从白癜风病因出发，探讨单胺类神经递质去甲肾上腺素对黑素细胞生物活性的影响。
　　 目的:
　　 1、探讨不同浓度的去甲肾上腺素(NE)对体外培养的黑素细胞增殖、酪氨酸酶活性、黑素生成及细胞凋亡的影响。
　　 2、明确NE对体外培养的人黑素细胞的生物学作用，为进一步探讨白癜风的神经精神病因学说提供可能的依据。
　　 对象和方法:
　　 1、黑素细胞的培养及鉴定
　　 (1)分离小儿包皮进行原代细胞纯化培养获得，使用第2代或是第3代的细胞进行实验。
　　 (2)采用L-Dopa染色和抗S-100免疫细胞化学染色两种方法进行鉴定。
　　 2、MTT法绘制第二代黑素细胞的生长曲线
　　 3、实验干预分组
　　 实验分为5个组：(1)对照组：不加任何处理因素的培养基；(2)NE1组：加入含1μmol/LNE的培养基；(3)NE2组：加入含10μmol/LNE的培养基；(4)NE3组：加入含50μmol/LNE的培养基；(5)NE4组：加入含100μmol/LNE浓度的培养基。
　　 4、研究方法
　　 (1)MTT法测定各组黑素细胞的增殖
　　 将细胞以1×104的浓度接种于96孔板，每孔200μl，24h待细胞贴壁后，吸弃培养液，对照孔加入培养基，其余各孔分别加入含各浓度药物培养基继续培养72h后，避光条件下于超净台上每孔加5g/L MTT20μl，继续置CO2孵箱培养4h。吸弃培养液，每孔加入150μl DMSO，充分振摇培养板，酶标仪测定每孔A490nm吸光度值。
　　 (2)测定各组细胞酪氨酸酶活性
　　 将细胞接种于24孔板中，24h后吸弃培养液，对照孔加入培养基，其余各孔分别加入含各浓度药物培养基继续培养72h后，吸弃培养液，PBS冲洗，加入0.25％的胰酶-EDTA0.5ml消化1分钟左右，加入消化终止液0.5ml，吹打成单细胞悬液，分别进行细胞记数，4℃离心，PBS洗两次，加入1.0ml裂解液，振荡重悬，4℃放置1h，离心，获得含有酪氨酸酶的上清液，将1ml的上清液加入L-Dopa反应液3.0ml中，37℃孵育20min，分光光度计检测生成的多巴色素的吸光度(A475)。
　　 (3)NaOH法测定各组细胞黑素含量
　　 将接种于24孔板中，24h后吸弃培养液，对照孔加入培养基，其余各孔分别加入含各浓度药物培养基继续培养72h后，吸弃培养液，PBS冲洗，加入0.25％的胰酶-EDTA0.5ml消化1分钟左右，再加入消化终止液0.5ml，吹打成单细胞悬液，分别进行细胞记数，各细胞悬液1000转/分离心5分钟，倾倒上清，每管加入1mol/L NaOH溶液，振荡5分钟，475nm分光光度计检测。
　　 (4)流式细胞仪检测不同浓度去甲肾上腺素对黑素细胞凋亡率的影响
　　 将细胞接种于6孔板中，24h后吸弃培养液，对照孔加入培养基，其余各孔分别加入含各浓度药物培养基继续培养72h后，吸弃培养液，PBS冲洗，0.25％的胰酶-EDTA消化、离心，送我院流式细胞室进行检测。
　　 5、统计学处理
　　 结果以x±s表示，各浓度组间差异采用单因素方差分析(one-wayANOVA)。数据采用SPSS13.0统计软件包分析，P＜0.05表示有统计学差异。
　　 结果:
　　 1、顺利培养出大量高纯度的人黑素细胞
　　 通过形态观察和生物学鉴定证实，使用分离酶-胰酶两步消化法和添加HMGS的M254培养基能从小儿包皮中得到大量高纯度的表皮黑素细胞，细胞在10天左右达到生长高峰。
　　 2、去甲肾上腺素对黑素细胞增殖活性的影响
　　 去甲肾上腺素浓度为100μmol/L时，可见数小时后培养板内黑素细胞大部分漂浮，死亡甚至裂解，其生长率及各项检测结果均未能测出。去甲肾上腺素的浓度是1、10、50μmol/L时，全自动酶标仪测得各浓度组黑素细胞的增殖率分别是97.21％±3.81％、81.81％±9.83％、74.63％±11.42％，与空白对照组(=100％)及组间均有统计学差异(P＜0.05)，证实去甲肾上腺素对体外培养的人黑素细胞的增殖有明显的抑制作用，且呈浓度依赖性。
　　 3、去甲肾上腺素对黑素细胞酪氨酸酶活性的影响
　　 黑素细胞与不同浓度的去甲肾上腺素一起培养72h后，三种浓度(1、10、50μmol/L)的去甲肾上腺素均能抑制黑素细胞的酪氨酸酶活性，紫外分光光度计测得各组数据结果分别为88.33％±6.45％、76.81％±8.34％、58.50％±6.76％，与空白对照组(=100％)及组间均有统计学差异(P＜0.05)，证实去甲肾上腺素对体外培养的人黑素细胞酪氨酸酶活性有明显的抑制作用，且呈浓度依赖性。
　　 4、去甲肾上腺素对黑素细胞黑素合成的影响
　　 通过紫外分光光度计检测不同浓度去甲肾上腺素作用72h后黑素细胞的黑素含量的变化，发现三种浓度(1、10、50μmol/L)的去甲肾上腺素均能显著抑制黑素合成，各组数据结果分别是82.75％±8.95％、67.20％±12.67％、56.08％±9.79％，与空白对照组(=100％)及组间均有统计学差异(P＜0.05)，证实去甲肾上腺素对体外培养的人黑素细胞的黑素合成有明显的抑制作用，且呈浓度依赖性。
　　 5、去甲肾上腺素对黑素细胞凋亡的影响
　　 三种不同浓度的去甲肾上腺素作用后的黑素细胞送流式检测凋亡率分别是0.79％、0.82％、1.08％，对照组为0.76％，重复实验结果凋亡率分别为1.08％、1.01％、0.92％，对照组为0.80％。
　　 结论:
　　 1、去甲肾上腺素对体外培养的人黑素细胞的增殖有明显的抑制作用，且呈浓度依赖性。
　　 2、三种浓度的去甲肾上腺素均能抑制黑素细胞的酪氨酸酶活性。
　　 3、三种浓度的去甲肾上腺素均能显著抑制黑素细胞的黑素合成。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文词汇对照

声明

第1章 前言

第2章 研究目的

第3章 材料与方法

第4章 实验结果

第5章 讨论

第6章 结论

参考文献

主要试剂配制

附录

致谢