小鼠不同组织来源的诱导多能干细胞心肌分化能力的比较

摘要

背景：冠心病（CAD），如心肌梗死和缺血性心肌病，是全球导致死亡的首位疾病之一。缺血导致了可工作的心肌细胞的永久性丢失，从而导致多种心力衰竭。目前传统的治疗手段包括药物治疗和再血管化外科手术，新的治疗手段也逐渐出现。在最近几年中，心脏再生领域被研究的较为深入。在该领域众多的科学研究中，以干细胞为载体的细胞治疗人类的疾病被认为是最有发展的前景。诱导多能干细胞(iPSCs)可以由体细胞重编程而来，通过内源性的表达被称为山中伸弥转录因子的Oct4，Sox2，c-Myc和Klf-4四种转录因子。这些诱导多能干细胞保持着巨大的心肌细胞生成的潜力，这使得它们成为理想的细胞模型，可以提供可再生心肌细胞以用于心肌梗死的细胞治疗。但是，目前还没有一种有着最大的心肌细胞分化能力的理想细胞类型被发现。咀嚼肌细胞(MMC)具有ISL-1+的特征，这是一种与干细胞及先祖细胞特性有关的基因标记，可以促进细胞向多种心脏及血管谱系的细胞自我分化。该实验基于以下的假设，咀嚼肌细胞系的再生能力可以增强其向心肌方向的分化，因而能够使其成为绝佳的细胞移植治疗手段的细胞类型。
　　方法：从小鼠身上分离几种不同的体细胞，包括咀嚼肌细胞（MMC），皮肤成纤维细胞（Fib)，骨髓间充质细胞（BMC)，躯干骨骼肌细胞（TMC)。随后将Oct4， Sox2, c-myc和Klf-4这四种转录因子通过反转录病毒导入到所有的四种体细胞中从而得到四种诱导多能干细胞系。通过3D培养的方法分化这四种诱导多能干细胞系并在它们分化过程中比较其分化发育的潜力和效率。
　　结果：在体外培养的条件下，四种体细胞经过重编程为诱导多能干细胞，具有相同的干细胞的特性，内源性表达了Oct4, Klf4, Sox2和Nanog等干细胞特征性的基因，以及表达了 SSEA-1和 Oct4等胚胎干细胞的特征性蛋白标记。四种来源的诱导多能干细胞重编程的效率没有差别。在向心肌细胞的分化阶段，经过分化的诱导多能干细胞出现自发性跳动，而由咀嚼肌细胞重编程而来的诱导多能干细胞向心肌分化时有80％出现跳动，远远高于其他三种体细胞来源的iPSCs，这说明咀嚼肌细胞来源的iPSCs心肌分化率高于其他三种细胞。在心肌特征性基因的表达情况方面，由咀嚼肌来源的iPSCs分化为的心肌细胞在ISL-1，NKX2-5， GATA4基因表达上调，并高于其他三种体细胞来源的iPSCs分化的心肌细胞。
　　结论：由小鼠咀嚼肌细胞重编程而来的诱导多能干细胞比成纤维细胞，骨髓间充质细胞和躯干骨骼肌细胞来源的诱导多能干细胞具有更好的向心肌方向的分化能力。表观遗传的作用在咀嚼肌细胞来源的诱导多能干细胞心肌分化潜能中起到巨大作用。

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第一章 前言

第二章 材料与方法

2.1 实验动物

2.2 主要试剂

2.3 主要仪器

2.4主要实验方法

第三章 实验结果

3.1 分离后的咀嚼肌细胞（MMC）,骨髓间充质细胞（BMC）,成纤维细胞（Fib）,骨骼肌细胞（SMC）的形态观察及鉴定

3.2 四种iPSCs形态观察及鉴定

3.3 iPSCs向心肌细胞分化效率及心脏发育特征性基因检测

3.4 心肌发育特异性基因和蛋白质检测

3.5 ISL-1基因启动子区DNA甲基化结果

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

英文缩略词列表

攻读硕士期间成果

致谢