脐带间充质干细胞改善大鼠胰岛细胞功能的旁分泌机制

摘要

目的：
　　探讨并验证人脐带间充质干细胞（HUC-MSCs）治疗糖尿病可能与人 IGF1、HGF、PDGFA等干细胞旁分泌因子保护胰岛β细胞功能，改善其活性有关，并初步揭示了这些旁分泌因子保护胰岛β细胞可能与抑制其凋亡有关。
　　方法：
　　本课题分为三个部分。首先健康胎儿的脐带收集、培养，获得HUC-MSCs，然后将2-3代生长良好的HUC-MSCs通过免疫荧光标记，移植入链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠模型体内，观察 HUC-MSCs对糖尿病大鼠的体重、血糖症状的改善作用，免疫组织化学染色检测大鼠胰岛β细胞的状态和功能，酶联免疫检测大鼠胰腺中人IGF1、HGF、PDGFA等旁分泌细胞因子的表达，免疫荧光标记观察HUC-MSCs在胰腺组织中的定植。
　　其次，我们分离大鼠原代胰岛细胞，通过与HUC-MSCs共培养，构建大鼠原代胰岛细胞-HUC-MSCs共培养体系，检测共培养组和单独培养组胰岛细胞活性，胰岛素、C肽分泌表达量，同时也检测人IGF1, HGF, PDGFA的表达。同时通过siRNA技术对细胞因子IGF1沉默后，检测沉默共培养组和正常共培养组胰岛细胞的活性及功能状态。
　　最后，我们利用Western blotting、定量PCR等技术方法，在体内及体外探讨细胞凋亡指标caspase-3、Bcl-2以及PI3K、MAPK磷酸化等信号通路在胰岛细胞凋亡和功能中的可能分子机制。
　　结果：
　　1：观察到移植干细胞糖尿病组的大鼠体重及血糖明显改善，并且免疫荧光显示干细胞在胰岛组织中大量定植，大鼠血清胰岛素、C肽等胰岛β细胞功能指标破坏减轻，同时该组的大鼠体内未检测到人胰岛素基因的表达，提示人脐带间充质干细胞不能在大鼠体内微环境作用下定向分化为胰岛素样细胞。同时我们检测到人IGF1, HGF, PDGFA等旁分泌因子的高表达，提示人脐带间充质干细胞的旁分泌因子可能在抑制胰岛β细胞的凋亡及保护功能中起重要作用。
　　2：体外构建大鼠原代胰岛细胞及人脐带间充质干细胞共培养体系，发现共培养组胰岛细胞的活性及功能得到明显保护，而且人IGF1, HGF, PDGFA等因子分泌明显增加，尤以 IGF1表达量增加最多，这种表达模式与在体内观察到的一致。沉默人脐带间充质干细胞 IGF1基因后，观察到沉默共培养组比正常共培养组胰岛细胞活性和功能明显下降。可见细胞因子IGF1，其对大鼠胰岛细胞的活性及功能保持具有重要作用。均提示旁分泌因子尤其是IGF1在胰岛细胞的活性和生物学作用中发挥着重要作用。
　　3：利用Western blotting、定量PCR等技术方法，我们观察到移植组和共培养组的细胞凋亡指标caspase-3、Bcl-2以及PI3K、pERK磷酸化等信号通路明显激活，推测可能旁分泌因子保护胰岛细胞功能可能与减少胰岛细胞凋亡、激活PI3K、pERK磷酸化等信号通路有关。

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第一章 绪 论

1.1 背景

1.2 间充质干细胞旁分泌作用的定义、生理功能

1.3 间充质干细胞的旁分泌作用与胰岛细胞的修复

1.4 研究基金来源

1.5 研究目标和研究内容

第二章 人脐带间充质干细胞在糖尿病大鼠体内的定植研究

2.1 引言

2.2 研究方案

2.3 材料和方法

2.4 主要观察指标

2.5 统计学方法

2.6 结果

2.7 讨论

第三章 人脐带间充质干细胞与大鼠原代胰岛细胞共培养研究

3.1 引言

3.2 研究方案

3.3 材料和方法

3.4 主要观察指标

3.5 统计学方法

3.6 结果

3.7 讨论

第四章 胰岛细胞凋亡信号通路相关基因的活化研究

4.1 引言

4.2 研究方案

4.3 材料和方法

4.4 统计学方法

4.5 结果

4.6 讨论

小结与展望

主要实验结果：

问题与展望：

参考文献

附录1 试剂配置

附录2 硕士期间发表学术论文情况

致谢