脊髓鞘内注射慢病毒介导前强啡肽基因修饰骨髓间充质干细胞治疗骨癌痛大鼠的镇痛效应

摘要

研究目的：
　　1、强啡肽镇痛效应强、安全性好、无呼吸抑制和成瘾性等优势，是目前生物镇痛研究的重点。探讨慢病毒介导的大鼠前强啡肽(PDYN)基因在骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)中的表达，为后续研究大鼠癌痛模型的生物镇痛提供条件。
　　2、探讨脊髓鞘内注射前强啡肽基因（PDYN）修饰骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)治疗骨癌痛大鼠的镇痛效应。
　　研究方法：
　　1、采用贴壁筛选法分离和扩增BM-MSCs，流式细胞学和体外成脂、成骨细胞诱导分化实验鉴定。构建大鼠PDYN慢病毒载体并感染BM-MSCs，倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达和 Western blot法筛选最适感染复数(MOI)；实验分为空白组(BM-MSCs)、实验组（PCDH-CMV-PDYN-EF1-copGFP）、空载体(PCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP)，采用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)和Western blot检测PDYN表达变化，采用免疫细胞化学染色法检测强啡肽(DYN)蛋白表达。
　　2、将含5×106/ml MADB-106大鼠乳腺癌细胞注射到SD大鼠胫骨靠近干骺端骨髓腔，制作骨癌痛模型（B组），同时设对照组（C组，n=8）。所有大鼠于术前1天、术后3、5、7、10、14天测定热刺激缩足潜伏期（paw withdrawal thermal latency,PWL）、自由行走痛评分、机械刺激缩足阈值（paw withdrawal mechanical threshold,PWT）疼痛行为学指标。骨癌痛模型制备成功的B组（n=24）采用随机数字法均分为3组，分别鞘内注射无菌生理盐水20μl(B1组)、鞘内注射BMSCs-VESTOR细胞悬液20μl(B2组)、注射BMSCs-PDYN细胞悬液20μl(B3组)。鞘内注射后3、5、7、10、14天检测疼痛行为学指标，最后一次行为学检测后处死大鼠并取L4-6节段脊髓组织，采用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)测定PDYN mRNA 表达，Western Blot和石蜡切片免疫组化测定脊髓背角强啡肽(DYN)蛋白表达。另采用裸鼠致瘤实验检验该细胞系的安全性。
　　研究结果：
　　1、BM-MSCs呈长梭形纤维细胞样贴壁生长，多数表达CD29、CD44、CD90，少数表达CD45。成脂诱导培养后油红O染色为阳性；成骨诱导培养后出现矿化结节，经茜素红染色呈橘红色。流式细胞仪检测示BM-MSCs细胞中CD29、CD90、CD44、CD45阳性率分别为（99.80±0.19）％、（99.62±0.24）%、（96.86±1.27）%、（0.82±0.06）%，转染PDYN基因后BM-MSCs表面标记CD29、CD90、CD44、CD45阳性率分别为（99.59±0.34）%、（98.06±1.51）%、（95.23±0.71）%、（10.23±0.59）%。转染前后BM-MSCs干细胞特性差异无统计学意义（P>0.05）。经PCR扩增克隆测序鉴定慢病毒载体PCDH-CMV-PDYN-EF1-copGFP构建成功，重组慢病毒滴度为5×106IU/mL。绿色荧光蛋白的表达和Western blot结果示慢病毒MOI=100为最佳病毒感染复数。qPCR、Western blot检测到经慢病毒载体感染后的BM-MSCs中PDYN基因表达均上调（P<0.05），免疫细胞化学染色检测显示DYN蛋白表达显著增强。
　　2、与C组和术前基础值相比，B组大鼠在造模术后5天PWL逐渐缩短（P<0.05），PWT显著降低(P<0.05)，自由行走痛评分逐渐升高（P<0.05），术后14天差异尤为明显（P<0.05）；B组间经鞘内注射处理后，B3组PWL逐渐延长（P<0.05），自由行走痛评分降低（P<0.05），PWT逐渐升高(P<0.05)，而B1组和B2组在鞘内注射前后无显著变化(P>0.05)。B组大鼠脊髓组织的PDYN mRNA表达均高于C组(P<0.05)，且B3组较B1组、B2组PDYN mRNA表达显著上调(P<0.05)。Western Blot和石蜡切片免疫组化结果显示B组与C组比较DYN蛋白表达显著增强(P<0.05)，B3组较B1组、B2组DYN蛋白表达显著增强(P<0.05)，B1组和B2组比较无统计学差异(P>0.05)。裸鼠致瘤实验表明注入BMSCs-PDYN细胞系未发现致瘤性。
　　研究结论：
　　1、成功培养BM-MSCs和构建大鼠PDYN基因过表达慢病毒载体，在BM-MSCs中能高效稳定表达PDYN基因和分泌DYN蛋白。
　　2、鞘内注射前强啡肽基因修饰骨髓间充质干细胞能上调骨癌痛大鼠脊髓PDYN mRNA表达，脊髓背角强啡肽蛋白表达显著增加，从而有效改善骨癌痛大鼠的镇痛作用。
　　3、该细胞系未发现致瘤性，成为镇痛载体细胞是安全的，用于细胞疼痛移植治疗。

目录

声明

中英文缩略词

背景与目的

第一部分 慢病毒介导的大鼠前强啡肽基因在骨髓间充质干细胞中的表达

1.1前言

1.2实验材料

1.2.1实验动物

1.2.2实验试剂

1.2.3菌种，质粒

1.2.4实验仪器

1.2.5实验试剂配制

1.2.6 实验器械准备

1.3实验方法

1.3.1 SD大鼠骨髓间充质干细胞培养流程

1.3.2 BM-MSCs体外向成骨、成脂细胞诱导分化成骨诱导分化步骤：

1.3.3 PDYN重组慢病毒载体构建、鉴定和测序

1.3.4 PDYN重组慢病毒包装及病毒滴度测定

1.3.5 绿色荧光蛋白的表达和最适感染复数(MOI)测定

1.3.6 大鼠BM-MSCs感染及实验分组

1.3.7 Western blot检测PDYN蛋白表达

1.3.8实时荧光定量PCR检测PDYN mRNA表达

1.3.9免疫细胞化学染色检测DYN蛋白表达

1.3.10统计学方法

1.4实验结果

1.4.1 BM-MSCs体外培养、扩增和向成骨、成脂诱导分化

1.4.2 BM-MSCs转染前与转染后表面标记CD29、CD90、CD44、CD45检测

1.4.3 PDYN重组慢病毒载体的构建及鉴定

1.4.4 PDYN重组慢病毒载体测序及病毒滴度测定

1.4.5绿色荧光蛋白的表达和最适MOI测定

1.4.6 Western blot检测各组PDYN蛋白表达

1.4.7 实时荧光定量PCR检测各组中PDYN mRNA表达

1.4.8免疫细胞化学染色检测强啡肽蛋白表达

1.5实验讨论

第二部分 脊髓鞘内注射慢病毒介导前强啡肽基因修饰骨髓间充质干细胞治疗骨癌痛大鼠的镇痛效应

2.1前言

2.2实验材料

2.2.1实验动物

2.2.2主要材料和仪器

2.3 实验方法

2.3.1细胞准备

2.3.2 骨癌痛模型的制备

2.3.3 疼痛行为学测试

2.3.4实验分组

2.3.5 动物给药

2.3.6 Western blot检测DYN蛋白表达

2.3.7 PCR检测PDYN mRNA表达

2.3.8免疫组织化学测定脊髓背角DYN蛋白表达

2.3.9 裸鼠致瘤实验

2.3.10统计学方法

2.4 实验结果

2.4.1 MADB-106大鼠乳腺癌细胞

2.4.2骨癌痛大鼠模型建立

2.4.3鞘内注射改善骨癌痛行为作用

2.4.4四组鞘内注射大鼠脊髓PDYN mRNA表达

2.4.5大鼠L4-6节段脊髓背角DYN蛋白的表达

2.4.6 石蜡切片免疫组化法测定各组脊髓背角强啡肽蛋白表达

2.4.7 裸鼠致瘤实验

2.5 实验讨论

参考文献

综述:移植转基因骨髓干细胞治疗癌痛的研究进展

论文发表情况

个人简历

致谢