非对称和对称IVIG对小鼠黑色素瘤的预防和治疗机制研究

摘要

目的：
　　免疫球蛋白G(IgG)是一类具有抗体活性可与对应抗原特异性结合的一类球蛋白，而静脉注射免疫球蛋白G(IVIG)其生产来源自至少1000名以上健康献血志愿者，所得血浆进行混合，分离，再提纯而来的。所以说IVIG是一种具有抗体活性并且含有广谱抗菌和抗病毒作用的IgG总和。Margni RA等课题组在20世纪80年代发现在IgG分子中存在一种异常糖基化的IgG，这种免疫球蛋白在其Fab段的一端存在糖基，而另一端没有，使得IgG分子不对称，我们称之为非对称 IgG。这种非对称IgG只能与抗原单价结合，其结合能力比对称IgG弱百倍，并且不能引起下游有效的免疫效应发生，如CDC、ADCC等。黑色素瘤又被称为恶性黑色素瘤，其恶性性程度高，侵袭性强，远处转移发生早，是威胁患者生命健康的最主要因素。相关研究报道，IVIG在动物肿瘤转移模型中对肿瘤在体内的生长和转移起到了明显的抑制作用。但关于IVIG对肿瘤的预防是否有效及其在体内IgG如何产生作用尚无确切报道。在本次研究中，我们探索了IVIG和非对称IgG对于小鼠黑色素瘤肺转移的预防作用和对生存期的影响作用及其可能的作用机制。
　　方法：
　　⑴成长至7到8周龄的C57BL/6雌鼠均订购于北京市维通利华实验动物公司，空运至汕头大学医学院并饲养于汕大医学院实验动物中心的SPF级实验动物房。⑵注射使用的小鼠黑色素瘤细胞B16F10均订购于武汉Procell生命科技有限公司，培养于培养基为胎牛血清浓度为10％的DMEM培养基中，置于CO2浓度为5%，温度为37℃的恒温培养箱中。⑶订购于北京索莱宝科技有限公司的小鼠干粉IgG，储存于-20℃冰箱内，用PBS溶液溶解，现用现配。人IVIG为上海莱士公司生产，储存于4℃冰箱内，用PBS稀释，调PH至7.4。⑷将用PBS溶解稀释后的IgG,反复经过装有rProteinG的亲和层析柱，结合在层析柱上的即为纯净的总IgG。⑸将提纯所得的总IgG热变性后，进行SDS-PAGE电泳，使用硝酸银染色显示电泳条带，用来鉴定目的蛋白条带的纯度。⑹将购买来的7到8周龄的C57BL/6雌鼠采用尾静脉注射的方法注射1.5×105，2.0×105个B16F10细胞，一般肿瘤在第15天会形成肺转移灶。利用该动物模型进行预防实验设计。⑺选取黑色素瘤的特异抗体ki67、gp100、mmp-2和mmp-9来对肺组织进行免疫组化染色，并对其阳性率进行统计学分析，来判断IVIG对小鼠黑色素瘤肺转移的预防作用。⑻采用R&D公司的Mouse Cytokine Array Kit小鼠细胞因子蛋白芯片试剂盒，对各组间分泌的炎性因子进行统计学分析。
　　结果：
　　①按照上述建模方法，小鼠的黑色素瘤肺转移成瘤率为100%。②经银染鉴定，本实验中所用到的小鼠 IgG与人 IgG由两条带构成且无明显混杂蛋白条带。③IVIG预防性注射可以有效的抑制小鼠黑色素瘤的肺转移的发生。④对称IgG对小鼠黑色素瘤肺转移的抑制作用较好于非对称IgG对小鼠黑色素瘤肺转移的抑制作用。⑤未进行IVIG预防性注射的小鼠肺组织免疫组化显示 ki67和 gp100的阳性率明显高于预防组的小鼠。⑥预防性接种低剂量的IVIG可以有效抑制黑色素瘤细胞的增殖同时抑制MMP-2和MMP-9蛋白的表达。⑦经蛋白芯片检测小鼠血浆内的细胞因子，得出以下结论：IVIG可以刺激小鼠并促进机体产生 BLC,IL-1ra；IVIG可以抑制小鼠机体产生IP-10,JE,KC,MIP-2,TIMP-1,TNF-a。
　　结论：
　　预防性注射IVIG可以有效的抑制黑色素瘤在小鼠体内的肺转移，而IVIG起到预防和抑制作用的可能机制是通过影响小鼠体内各种炎性因子的分泌从而达到抑制肿瘤生长和转移的效果。分析蛋白芯片结果得出IVIG可以刺激小鼠并促进机体产生TNF-a， IL-1ra;IVIG则抑制小鼠机体产生以下可能对肿瘤生长有促进作用的炎性因子BLC,C5/C5a,G-CSF,IL-1β,IP-10,MIG,MIP-2,TIMP-1,TREM-1,IL-4,IL-7。

目录

声明

缩略词

第一章 前言

第二章 材料和方法

2.1材料

2.2BCA法蛋白浓度检测

2.3硝酸银染色技术

2.4提纯 IgG步骤

2.5使用 ConA亲和层析柱分离对称 IgG和非对称 IgG

2.6蛋白质的浓缩和置换

2.7B16F10黑色素瘤细胞培养方法

2.8B16F10黑色素瘤细胞悬液的制备

2.9免疫组织化学染色技术

2.10免疫组织化学染色打分

2.11小鼠细胞因子蛋白芯片技术

第三章 实验结果

3.1对称 IgG、非对称 IgG的分离银染结果

3.2动物实验结果

3.3预防性接种低剂量的 IVIG可以有效抑制黑色素瘤细胞的增殖同时抑制 MMP-2和 MMP-9蛋白的表达

3.4预防实验中小鼠血清中细胞因子的蛋白芯片检测结果

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

致谢

个人简历