改良扩增前引物延伸方法的法医学应用研究

摘要

研究背景与目的 在法医学检案实践中，常遇到样本DNA含量极其有限，以致DNA分型无法完成或不能满足重复检测的需要。因此，对微量模板DNA分析便成为法医学DNA检验的一个难题。以PCR-STR为代表的遗传标记分析技术虽然一定程度上解决了法医学微量检材的难题，但一些检材仍因DNA含量极其有限而无法检测成功，或仅检出少数基因座而无法使累计鉴别能力达到认定水平。这类检材被称为痕量DNA，也称低拷贝模板(low copy number，LCN)，Gill等将其定义为低于100pg的模板DNA。为解决这一难题，有研究用增加PCR循环数，但模板DNA量太低时易产生等位基因丢失或非特异带，且循环数增加到一定程度后再增加循环数也不会显著增加灵敏度；另外，有人试图用巢式PCR，但巢式PCR技术仅限于单一位点分析，无法提高目前法医学中常规DNA检测所用的多位点复合扩增所需的模板数量。全基因组扩增(Whole Genome Amplification，WGA)是一种能从有限的DNA样品获得充足的DNA量供后续分析的技术，其基本思路是通过对微量组织甚至单个细胞的整个基因组DNA扩增，大幅度增加DNA的总量。因此被认为是目前可以解决上述难题的一种有效方法。 WGA技术经10余年探索，在方法上已逐步发展和不断完善起来，已被广泛用于疾病基因研究等领域，并取得了良好的效果。但在法医学方面的应用很少。在目前常用的几种wGA方法中，改良扩增前引物延伸方法(Improved primerextension preamplification，IPEP)和多重置换扩增方法(multipledisplacement amplification，MDA)对STR基因座分型显示出较好的效果。故本研究探讨了这两种方法用于法医学微量检材的效果，包括对其灵敏度、扩增忠实性、能否用于法医学常用STR基因座及常用检材等进行系统性研究，从而对其用于法医学实践的可行性进行评价，并建立稳定可行的技术方案。 方法：1．对30例口腔拭子样品，采用酚－氯仿法提取DNA，实时荧光定量PCR技术定量，并分别稀释成1ng、0.5ng、0.1ng、0.05ng、0.025ng、0.01ng六种模板量DNA，然后进行MDA反应和IPEP反应。采用实时荧光定量PCR技术检测MDA方法和IPEP方法的产物浓度，比较两种方法的扩增效率。分别以MDA产物和IPEP产物为模板DNA，用AmpFLSTR Identifiler 试剂盒扩增，ABl3100基因分型仪检测基因型，比较MDA产物和IPEP产物用于STR分型的效果。 2．对IPEP方法反应体系的成分和终浓度进一步优化，建立改良IPEP方法，并检测其扩增效率和STR分型效果。将改良IPEP方法用于30例血液、30例血纱、30例精液等三类法医学常见生物检材进行检测，观察改良IPEP方法的可重复性和对法医学常见生物性检材的适用性。 3．将改良IPEP方法用于20例汗潜指印、20例一次性牙刷、20例自然脱落头发等三种法医学常见疑难微量检材的模拟案例，观察改良IPEP方法对上述检材的STR分型效果；用于现场果核10例、矿泉水瓶10例、烟蒂10例、衣领10例等实际案例样品，观察改良IPEP方法对实际案件中微量DNA样品的检验效果。 结果 1．MDA法产量为5.15μg～19.75μg，可对模板DNA增加5.15×10<'3>～1.98×10<'6>倍；IPEP法产量为0.5ng～66ng，可对模板DNA增加25～310倍。MDA法产物浓度高于IPEP法，差异有显著性意义(F=3643.433，P<0.001)。 2．常规检测法、MDA法、IPEP法的基因座检出数有显著性差异(F=1033.297，P<0.001)。当DNA模板量为1ng时，常规检测方法、MDA方法、IPEP方法均可获得复合扩增系统所有基因座的准确分型结果；当DNA模板量为0.5ng时，常规检测方法和IPEP方法均获得所有基因座的准确分型结果，MDA法获得10个以上基因座的准确分型结果；当DNA模板量为0.1ng～0.01ng时，MDA法基因座检出数高于常规检测法，IPEP法基因座检出数高于MDA法。3．DNA模板量≥1ng，其MDA产物杂合子基因座的等位基因扩增均衡：DNA模板量≤0.5ng，其MDA产物的STR分型图谱可见等位基因不平衡或丢失现象，且模板DNA量越低，等位基因不平衡或丢失现象越明显。DNA模板量≥0.05ng，其IPEP产物杂合子基因座的等位基因扩增均衡；DNA模板量≤0.025ng，其IPEP产物的STR分型图谱可见等位基因不平衡或丢失。MDA产物和IPEP产物用于STR分型时均未观察到非特异产物峰。 4．采用保真性更好的DNA聚合酶和增加随机引物用量，建立了改良IPEP方法。0.1ng、0.05ng、0.025ng、0.01ng四组模板量DNA经改良IPEP法扩增所得产物浓度均高于IPEP法，差异有显著性(F=289.899，P<0.001)。改良IPEP法对上述模板DNA扩增获得3ng～84ng产物，可使模板DNA增加160～1220倍。DNA模板量为0.025ng时，改良IPEP方法可获得完整准确的分型结果。DNA模板量为0.01ng时，改良IPEP法的平均基因座检出数高于IPEP法，部分基因座仍未检出，以D7S820、D18S51、FGA等较常见。改良IPEP方法的产物用于STR分型时，未见非特异产物峰及等位基因不平衡或丢失。 5．改良IPEP方法对0.025ng血液DNA、血纱DNA、精液DNA检测均获得所有基因座的准确分型结果。 6．改良IPEP方法可显著提高汗潜指印DNA(t=5.423，P<0.001)、一次性牙刷DNA(t=6.835，P<0.001)的基因座检出数，但对自然脱落毛发DNA的基因座检出数低于常规检测法(t=3.249，P<0.001)。改良IPEP方法对实际案件中果核、杯口、烟蒂、衣领等检材的的检测成功率和平均基因座检出数均高于常规检测方法，且检出STR基因座数均不少于9个。 结论 1．MDA法产量高，但灵敏度低，当模板量低于1ng时，产物序列保真性差，影响后续STR分型的准确性。因此，MDA法可能不适用于痕量DNA检测。 2．IPEP法灵敏度高，产物序列保真性好，对0.05ng的基因组DNA可获得良好的STR分型效果，但产量低。 3．DNA聚合酶和随机引物用量对IPEP方法有重要影响。采用保真性更好的DNA聚合酶和增加随机引物至一定终浓度，提高了扩增效率。在此基础上建立的改良IPEP方法的产物序列保真性好，且产量和灵敏度都进一步提高，改善了痕量DNA的STR分型效果。 4．改良IPEP方法对于口腔拭子、血液、血纱、精液等不同生物性检材、不同状态的同种检材均获得准确可靠的结果，表明了改良IPEP方法的稳定性好，适用于上述法医学常见生物性检材。 5．改良IPEP方法可显著提高微量皮肤脱落细胞、微量口腔粘膜脱落细胞的检测成功率和平均基因座检出数，以满足法医学个体识别要求。但改良IPEP方法对自然脱落毛发这类降解的短片段DNA样品效果不佳。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一章MDA方法和IPEP方法扩增效率和STR分型效果比较

材料与方法

结果

讨论

参考文献

附图

第二章改良IPEP方法的建立

材料与方法

结果

讨论

参考文献

附图

第三章改良IPEP方法用于法医学实践的研究

材料与方法

结果

讨论

参考文献

附图

全文小结

附录

硕士期间发表和待发表论文

致谢