NKG2D介导的同种异体NK细胞对人鼻咽癌细胞CNE2及其多药耐药细胞CNE2/DDP杀伤活性的研究

摘要

背景与目的： 放疗、化疗是治疗鼻咽癌的主要手段，早期鼻咽癌通过单纯放疗即可达到根治。晚期鼻咽癌，尽管探索了多种方式的放疗、化疗联合治疗，但是仍有部分患者出现局部复发和远处转移，这很大程度归凶于癌细胞产生多药耐药性。耐药肿瘤细胞的存在，是治疗失败的主要原因，为此临床需要寻找治疗鼻咽癌的新方法，特别是针对耐药的鼻咽癌患者的治疗方法。异基因造血干细胞移植中，供者的同种反应性NK细胞能提高抗白血病的效应，最近的研究证实，同种异体的NK能有效地杀伤原代的胃癌、肾癌、肠癌和卵巢癌肿瘤细胞，为此本研究想观察同种异体的NK是否具有杀伤鼻咽癌细胞的效应。 NK细胞对靶细胞的杀伤活性与其细胞表面的受体和靶细胞表面的配体密切相关。NK细胞表面的抑制性杀伤细胞免疫球蛋白样受体(inllibitory killer cellimmunoglobulin．1ike receptor，KIR)与靶细胞表面特定的HLA-Ⅰ类分子结合，介导对NK细胞毒活性的抑制效应，靶细胞缺乏ⅪR特定的配体将激发NK细胞对其杀伤活性。NKG2D是NK细胞表面的主要活化性受体，其配体为MHC-Ⅰ类链相关分子A或B(MHC class Ⅰ chain-related Inolecule A or B，MICA、MICB)及人巨细胞病毒UL16蛋白的结合蛋白(1auman cytomegalovirus glycoproteinUL16 binding proteins，ULBPs：ULBPl、ULBP2、ULBP3)，NKG2D和肿瘤细胞表面的相应配体结合，介导NK细胞的杀伤效应。NKG2D配体在多种肿瘤细胞表达，其在鼻咽癌细胞的表达尚未见报道。异基因造血干细胞移植中，当存在供者到受者方向的抑制性杀伤细胞免疫球蛋白样受体．配体错配时，供者的同种反应性NK细胞介导的抗白血病效应可以防止白血病复发。体外实验证实NK细胞能抑制慢性粒细胞白血病患者白血病CD34<'+>细胞形成粒细胞巨噬细胞集落形成单位，表明NK细胞对耐药的白血病细胞和白血病克隆形成细胞具有杀伤效应。有研究证实，KIR-配体错配的NK细胞可有效地杀伤原代的胃癌、肾癌、肠癌、卵巢癌肿瘤细胞，而无KIR-配体错配的NK细胞不具有杀伤活性。 基于以上研究，本研究想利用NK细胞的生物学特性，通过体内、外试验观察同种异体的NK细胞能否杀伤CNE2、CNE2/DDP细胞，如果杀伤，杀伤活性是否存在差异，杀伤差异的分子基础是什么，从而为鼻咽癌的治疗探索新的方法。 方法： 第一章 人鼻咽癌多药耐药细胞CNE2/DDP与亲本细胞CNE2的生物学特性差异研究 比较两者光镜下形态、生长特点，体外克隆形成率的差异；流式细胞仪分析两者细胞周期分布的差异、多药耐药蛋白P-170及ABCG2表达差异；MTT法分析其耐药谱；动物实验观察两者成瘤差异。 第二章 人鼻咽癌细胞CNE2及其多药耐药细胞CNE2/DDP HLA分型及HLA-Ⅰ类分子和NKG2D配体表达的检测 以体外培养的CNE2、CNE2/DDP细胞为靶细胞，以QIAampDNA抽提试剂提取CNE2、CNE2/DDP细胞的DNA；CNE2、CNE2/DDP细胞HLA分型采用序列特异性引物扩增法(sequence specific primei。polymerase chain reproduction，PCR-SSP)。RT-PCR检测NK细胞的主要活化性受体NKG2D的配体MICA、MICB、ULBPl、ULBP2、UL,BP3的表达情况。流式细胞仪检测CNE2、CNE2/DDP细胞表面HLA-Ⅰ类分子的表达，流式细胞仪及细胞免疫组化法检测NKG2D的配体MICA、MICB、ULBPl、ULBP2、ULBP3的表达情况。 第三章 同种异体NK细胞对CNE2、CNE2/DDP细胞体外杀伤试验研究 5例健康者，采静脉血以复方栒椽酸盐(acid citrate dextrose buffer，ACD-B)抗凝，以QIAampDNA抽提试剂提取5例健康者外周血细胞的DNA；PCR-SSP法测定KIR基因型；流式细胞仪检测K562细胞表面NKG2D配体和HLA-Ⅰ类分子的表达；免疫磁珠法分离纯化5例健康者的NK细胞，体外IL2培养24h，LDH释放法检测不同效靶比时，5例健康者的NK细胞对K562、CNE2、CNE2/DDP细胞的杀伤率；观察效靶比20：1时不同的NKG2D配体的单抗及HLA-Ⅰ类分子单抗对NK细胞杀伤活性的影响：观察效靶比20：1时NK细胞对CNE2、CNE2/DDP细胞体外克隆形成的影响。 第四章 NK细胞对人鼻咽癌细胞CNE2及其多药耐药细胞CNE2/DDP裸鼠皮下移植瘤的抑制作用 磁珠分离法从3例健康人外周静脉血中分离NK细胞，体外经IL2、植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)扩增。24只BALB/c裸鼠，分为4组，每组6只。CNE2对照组、CNE2/DDP对照组、CNE2+NK细胞治疗组、CNE2/DDP+NK细胞治疗组。对数生长期的CNE2、CNE2/DDP细胞，分别配制成每0.1ml含1xl0<'6>个肿瘤细胞的悬液，对照组裸鼠每只皮下接种lxl0<'6>的CNE2或CNE2/DDP细胞，治疗组裸鼠每只皮下接种lxl0<'6>CNE2或CNE2/DDP细胞同时每只经尾静脉注入3x10<'7>NK细胞，观察各组裸鼠成瘤时间、成瘤率、肿瘤体积变化、绘制肿瘤生长曲线。成瘤后3周，取裸鼠外周血，流式细胞仪检测人NK细胞，处死老鼠，取瘤块称重，计算抑瘤率，肿瘤组织常规病理检查。 结果： 第一章 人鼻咽癌多药耐药细胞CNE2/DDP与亲本细胞CNE2生物学特性差异的研究 第二章 人鼻咽癌细胞CNE2及其多药耐药细胞CNE2/DDP HLA-Ⅰ类分子和NKG2D配体的表达 第三章 同种异体NK细胞对CNE2、CNE2/DDP细胞体外杀伤试验研究 第四章 NK细胞对人鼻咽癌细胞CNE2及其多药耐药细胞CNE2/DDPBALB/c裸鼠皮下移植瘤的抑制作用 结论： 1.CNE2、CNE2/DDP细胞具有不同的生物学特性，与CNE2细胞相比，CNE2/DDP细胞具有生长缓慢，体外克隆形成率高，G<,0>/G<,1>期细胞比例高和多药耐药的特点。 2.CNE2、CNE2/DDP细胞mRNA水平均表达NKG2D的配体MICA、MICB、UL,BPl、ULBP2、UL,BP3；两种细胞表面均表达MICA、MICB、ULBP2，均不表达UL,BPl、UL,BP3；CNE2细胞表面MICA、MICB、HLA-Ⅰ类分子的表达较CNE2/DDP细胞明显增强；健康个体的KIR与CNE2、CNE2/DDP细胞表面的HLA-Ⅰ类分子之间存在错配现象。 3.NK细胞通过其主要活化性受体NKG2D和CNE2、CNE2/DDP细胞表面的配体MICA、MICB、ULBP2结合激活NK细胞参与杀伤CNE2、CNE2/DDP细胞；CNE2、CNE2/DDP细胞表面表达的HLA-Ⅰ类分子抑制NK细胞对其杀伤活性 4.NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性较对CNE2/DDP细胞的杀伤活性高；NK细胞能抑制CNE2、CNE2/DDP细胞体外克隆形成。 5.同种异体NK细胞能抑制人CNE2、CNE2/DDP细胞BALB/c裸鼠皮下移植瘤的生长。 本研究的创新点: 1.首次发现KIR-HLA信号通路和NlKG2D-配体信号通路共同参与NK细胞对CNE2、CNE2/DDP细胞的杀伤。 2.首次发现耐药鼻咽癌细胞与亲本鼻咽癌细胞表面HLA-Ⅰ类分子和NKG2D配体表达的差异，阐明了NK细胞对耐药鼻咽癌细胞与亲本鼻咽癌细胞杀伤活性差异的分子基础。 研究价值： 本研究使我们从新的角度认识免疫系统与耐药肿瘤细胞之间的关系，为研究提升免疫系统对耐药肿瘤细胞的杀伤效应提供了理论和实验依据。

目录

文摘

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论文说明：缩略词表

声明

前言

实验流程

第一章人鼻咽癌多药耐药细胞CNE2/DDP与亲本细胞CNE2生物学特性差异的研究

1.1实验材料

1.2实验方法

1.3实验结果

1.4讨论

1.5小结

1.6参考文献

第二章人鼻咽癌细胞CNE2及其多药耐药细胞CNE2/DDP HLA-Ⅰ类分子和NKG2D配体的表达

2.1实验材料

2.2实验方法

2.3实验结果

2.4讨论

2.5小结

2.6参考文献

第三章同种异体NK细胞对鼻咽癌亲本细胞CNE2及其多药耐药细胞CNE2/DDP体外杀伤活性的研究

3.1实验材料

3.2实验方法

3.3实验结果

3.4讨论

3.5小结

3.6参考文献

第四章NK细胞对人鼻咽癌细胞CNE2及其多药耐药细胞CNE2/DDP裸鼠皮下移植瘤的抑制作用

4.1实验材料

4.2实验方法

4.3实验结果

4.4讨论

4.5小结

4.6参考文献

综述：自然杀伤细胞受体及抗肿瘤研究进展

附表

成果

致谢