GPI-CD80表达载体的构建、在COS-7细胞的表达及其锚定功能的初步研究

摘要

本实验分三部分介绍人GPI-CD80融合蛋白从载体构建到蛋白表达以及锚定于肿瘤细胞膜的过程，为进一步借助细胞表面工程技术，研发基于CD80分子介导的肿瘤疫苗打下基础。 第一部分人GPI-CD80真核表达载体的设计与构建,CD58分子又称LFA-3，天然情况下具有跨膜和锚定两种形式，后者的基因中含有GPI锚定信号序列，据此可以作为目的蛋白的GPI序列来源。CD80分子也称B7-1，其胞外段具有与T细胞表面分子CD28结合的能力，进而活化T细胞。 目的： 设计获取源于人CD58的GPI锚定信号肽序列，并与人CD80基因胞外段融合，构建真核表达载体，即pReceiver-M10/GPI-hCD80，为后续实验准备必需的实验材料。 方法： 根据Genbank提供的人CD58和CD80基因的参考序列，设计引物P1、P2，PCR扩增CD80基因的胞外段，设计引物P3、P4 PCR扩增CD58基因的GPI信号序列，利用重叠延伸PCR技术(splicing overlap extension，SOE)将两片段拼连接起来，先连入T载体，再双酶切连入真核表达载体pReciever-M10。对构建的重组载体进行双酶切和测序鉴定。 结果与结论： PCR法成功获取了人CD80胞外段和来源于人CD58的GPI锚定信号序列。重组质粒中插入目的片断的测序结果与NCBI提供的参考序列基本相符，将该重组质粒命名为pReceiver-M10/GPI-hCD80。 第二部分 pReceiver-M10/GPI-hCD80载体在COS-7细胞的瞬时表达及产物的纯化与鉴定,COS-7细胞可以瞬时大量表达蛋白，可以用于迅速鉴定构建的载体可否在真核细胞中表达出目的蛋白，进而验证真核表达载体构建成功与否。 目的： pReceiver-M10/GPI-hCD80载体在COS-7细胞的瞬时表达及表达产物的纯化与鉴定，为融合基因的稳定表达奠定基础。方法：(1)大量提取超纯的pReceiver-M10/GPI-hCD80载体，脂质体法转染生长活跃的COS-7细胞，称实验组，转染不带目的基因的pReceiver-M10空载体作阴性对照，未转染的细胞作为空白对照。分别对实验组、阴性对照组及空白组细胞作如下检测，以分析CD80蛋白的表达情况：①间接免疫荧光检测；②流式细胞计数检测；③提取总蛋白作聚丙烯酰胺．凝胶电泳(sDS-PAGE)、Western blot；④提取总RNA做RT-PCR，产物进行琼脂糖凝胶电泳估计碱基数。 (2)PI-PLC处理：用PI-PLC，37℃处理实验组、空白对照组、阴性对照组、阳性对照组细胞(成功转染了人CD80基因的U251细胞)各1h，然后流式细胞计数处理前后细胞荧光强度的变化。 (3)融合蛋白的纯化：大量提取转染组COS-7细胞总蛋白；用Ni-NTA凝胶纯化柱纯化目的蛋白。纯化后的蛋白样品做SDS-PAGE。 结果与结论： (1)实验组：间接免疫荧光法可见COS-7细胞发出绿色荧光；流式细胞计数显示CD80<'+>细胞占32.7％；SDS-PAGE在约60KD位置有一明显蛋白条带，Westernblot显示出条带；RT-PCR后琼脂糖凝胶电泳在约840bp位置显示核酸条带。 对照组：各检测结果均为阴性。 (2)只有实验组在PIPLC处理后荧光强度明显变弱，对照组基本没有变化。 (3)纯化的蛋白SDS-PAGE结果位于约60KD处。 综合上述各实验结果，可以得出结论：重组质粒pReceiver-M10/GPI-hCD80转染COS-7细胞后，表达了GPI锚定形式的人CD80(GPI-hCD80)融合蛋白。 第三部分 GPI-CD80蛋白锚定于胶质瘤细胞系U251及原代胶质瘤细胞COS-7细胞表达的融合蛋白需具有GPI结构，该融合蛋白才可以锚定于肿瘤细胞膜。作为以临床应用为最终目的肿瘤疫苗，GPI-hCD80融合蛋白能否锚定于原代肿瘤细胞膜，具有重要意义。 目的： 从临床手术标本中分离培养原代胶质瘤细胞，将GPI-CD80蛋白锚定于胶质瘤细胞系U251及原代胶质瘤细胞膜表面，以证实生产的融合蛋白具有锚定功能，为后期大量生产蛋白用于动物实验提供实验依据。 方法： 胰酶消化法结合组织培养法，体外分离培养原代人胶质瘤细胞。将GPI-hCD80融合蛋白与消化处理的U251、原代胶质瘤细胞共孵育37℃，4 h，直接免疫荧光法观察肿瘤细胞膜表面GPI锚定形式CD80的表达情况。 结果与结论： 荧光显微镜下可见，锚定实验组两种细胞表面均发出红色荧光。说明GPI-hCD80融合蛋白可以借助GPI锚定结构结合于肿瘤细胞膜表面。 总结 成功获取了人CD80基因胞外段及来源于人CD58基因的GPI片段，并构建了人GPI-CD80真核表达载体pReceiver-M10/GPI-hCD80，并证实该载体在COS-7细胞中表达出的GPI-CD80融合蛋白具有锚定作用。为今后进一步研究该融合蛋白锚定于肿瘤细胞后的生物学活性，以及作为肿瘤疫苗在体内是否可以介导肿瘤细胞杀伤作用奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词中英文对照表

声明

研究背景及目的

第一部分 人GPI-CD80真核表达载体的设计与构建

1.1材料与方法

1.2结果

1.3讨论

1.4小结

第二部分 pReceiver-M10/GPI-hCD80载体在COS-7细胞的瞬时表达及产物的纯化与鉴定

2.1材料与方法

2.2结果

2.3讨论

2.4小结

第三部分 GPI-CD80蛋白锚定于胶质瘤细胞系U251、原代胶质瘤细胞

3.1材料与方法

3.2结果

3.3讨论

3.4小结

全文结论

参考文献

综述共刺激分子CD80的结构与功能及其在肿瘤免疫治疗中的应用前景

成果

致谢