母源性BDE-209暴露对仔代大鼠海马乙酰胆碱及一氧化氮神经递质的影响

摘要

本实验在课题组的前期实验基础上，从母胎医学角度，研究不同剂量BDE-209对仔鼠空间学习记忆能力的影响及剂量效应关系；进一步从乙酰胆碱能神经递质、NO神经递质方面探讨BDE-209对机体神经系统产生危害的作用机制，为下一步找到相应干预措施奠定基础。 第一部分不同剂量母源性BDE-209暴露对仔代大鼠空间学习记忆能力和海马组织结构的影响 目的：本研究建立不同剂量母源性BDE-209大鼠胃灌暴露模型，Morris水迷宫检测各组仔鼠的空间行为学，立足于母胎医学领域，研究不同剂量的BDE-209暴露对仔代大鼠的空间学习记忆能力的影响及其剂量效应关系，目前尚无相关报道。并从形态学角度比较光镜下各组仔鼠海马组织CA1结构的变化，旨在进一步研究母源性BDE-209对仔鼠神经毒性的结构基础。 方法： 1、建立BDE-209母源性暴露模型 3月龄的SPF级Wistar大鼠75只。分笼饲养7天，按雌雄比例为2:1合笼。以雌鼠阴道分泌物涂片发现活动的精子作为确定大鼠交配成功。 2、Morris水迷宫实验对仔鼠进行空间学习行为的检测：给动物编号，按随机数表法随机取各组第一代断乳后的雄性仔鼠各20只。每天固定时间每只仔鼠训练2次，每次分别从四个不同的入水点入水，其中前3天训练让仔鼠熟悉水迷宫及实验室环境，不记录成绩，后5天为正式测试。通过记录各组仔鼠的逃避潜伏期，比较仔鼠空间学习记忆能力。 3、仔鼠海马组织切片制作：Morris水迷宫试验结束后，从各组分别随机选取5只仔鼠观察其海马组织结构。依次应用生理盐水200ml、4％多聚甲醛磷酸盐缓冲液200ml灌注。灌注结束后，取海马组织，放于4％多聚甲醛磷酸盐缓冲液4℃冰箱中固定24小时，常规石蜡包埋，存于4℃冰箱。 结果： 1、母源性BDE-209对仔代大鼠空间学习记忆能力的影响 1.1主效应时间因素差异有统计学意义，各组潜伏期有随时间变化的趋势；时间和分组的交互效应无显著差异，说明时间因素的作用不随着分组的不同而不同。 1.2分组因素差异有统计学意义，说明分组因素起作用。 1.3每个时间点上5个分组之间的两两比较： 第1-2天，提示各组仔代大鼠空间学习记忆能力无显著差异。 第3-5天时，与对照组E组相比，①A组与E组潜伏期无显著差异，提示一定剂量母源性BDE-209暴露对仔鼠空间学习记忆能力无显著影响；②而B、C、D组潜伏期均延长，差异有统计学意义，说明暴露一定剂量的母源性BDE-209可导致仔鼠空间学习记忆能力下降。 2、HE染色光镜下观察各组仔鼠海马组织CA1区结构的变化：E组仔鼠海马各层组织结构层次清晰，神经细胞排列整齐，细胞轮廓清楚，细胞间隙正常，核居中，A、B组与对照组E无显著差异。但C、D组神经细胞数量显著减少，排列紊乱，细胞核固缩过半，细胞水肿。 结论： 提示低剂量母源性BDE-209暴露对仔鼠空间学习记忆能力无显著影响；达到一定剂量浓度的BDE-20方可导致仔鼠的空间学习记忆能力障碍且随着暴露剂量的增加，影响越显著。可见BDE-209对大鼠空间学习记忆能力影响与暴露剂量有着密切联系，即存在剂量效应关系；光镜下发现一定剂量的BDE-209的母源性暴露损伤仔鼠海马组织结构，这可能是其导致仔鼠神经系统损伤的结构基础。 第二部分母源性BDE-209对仔代大鼠海马胆碱能神经递质的影响 目的：本研究通过比较各组仔代大鼠海马组织胆碱能神经递质的变化，如乙酰胆碱纤维量、乙酰胆碱脂酶活性、毒蕈碱受体含量、烟碱受体含量，从胆碱能神经递质方面探讨BDE-209对仔鼠空间学习记忆损伤的可能机制，为下一步的干预奠定基础。 方法： 1、动物的处理与标本的收集： 动物模型同第一章。Moms水迷宫试验结束后，按随机数字表从每组分别随机选取10只仔鼠进行取材。固定动物，10％水合氯醛4ml/kg腹腔麻醉满意后，断头处死，剥出全脑，掀开大脑皮层，用眼科镊小心分离海马组织，4℃生理盐水漂洗去血液，放入冻存管，立即置于-170℃液氮内保存。将液氮灌中组织块取出，解冻，4℃预冷的生理盐水漂洗，滤纸拭干，称重，放入5ml的小烧杯内，移液管量加入冷生理盐水，眼科剪尽快剪碎组织块。组织捣碎机10000～15000r/min上下研磨制成10％组织匀浆，将制备好的10％匀浆用低速离心机3000r/min离心10～15分钟，将离心好的匀浆留取上清液。 2、检测各组仔鼠海马组织中乙酰胆碱纤维量、乙酰胆碱脂酶活性、毒蕈碱受体含量、烟碱受体含量。 结果： 1、仔鼠海马组织乙酰胆碱纤维量：各组组间ACH含量差异有统计学意义；与对照组E组相比，B、C、D组ACH含量下降，差异有统计学意义，A组与E组比较无显著差异。实验组间比较，D组ACH含量较A、B、C组均下降，差异有统计学意义。 2、仔鼠海马组织乙酰胆碱脂酶活性：各组组间ACHE含量差异有统计学意义；与对照组E组相比，B、C、D组ACHE活性下降，差异有统计学意义，A组与E组比较无显著差异。实验组间比较，D组ACHE活性较A、B、C组均下降，差异有统计学意义。 3、仔鼠海马组织毒蕈碱受体含量：各组组间M-ACHR含量差异有统计学意义；与对照组E组相比，仅C、D组M受体表达含量下降，差异有统计学意义，A、B组均与E组无显著差异。实验组间比较，D组M受体含量较A、B组均下降，差异有统计学意义。 4、仔鼠海马组织烟碱受体含量：各组组间N-ACHR含量差异有统计学意义；与对照组E组相比，仅D组的N受体的表达含量下降，差异有统计学意义，A、B、C组均与E组无显著差异。实验组间比较，D组N受体的含量较A、B组均下降，差异有统计学意义。 结论： 实验结果中不同剂量母源性BDE-209对仔鼠海马组织ACH含量、ACHE活性、M-ACHR含量、N-ACHR含量的影响并不完全相同，一定剂量母源性BDE-209可不同程度降低上述各相应指标，提示胆碱能神经递质是母源性BDE-209损伤仔鼠空间学习记忆能力的可能机制。 第三部分母源性BDE-209对仔代大鼠海马一氧化氮神经递质的影响 目的：母源性BDE-09暴露对仔代大鼠的学习记亿的损伤的具体机制，目前尚无相关报道。本研究通过比较各组仔代大鼠海马组织一氧化氮含量、神经元型一氧化氮合酶活性、环鸟苷酸含量，从NO神经递质方面探讨BDE-209对仔鼠学习记忆影响的可能机制，为下一步的干预奠定基础。 方法： 动物模型同第一章。Morris水迷宫试验结束后，采用随机数字表从各组分别随机选取10只进行取材。固定动物，10％水合氯醛4ml/kg腹腔麻醉满意后，断头处死，剥出全脑，掀开大脑皮层，用眼科镊小心分离海马组织，4℃生理盐水漂洗去血液，放入冻存管，立即置于-170℃液氮内保存。将液氮灌中组织块取出，解冻，4℃预冷的生理盐水漂洗，滤纸拭干，称重，放入5ml的小烧杯内，移液管量加入冷生理盐水，眼科剪尽快剪碎组织块。组织捣碎机10000～15000r/min上下研磨制成10％组织匀浆，将制备好的10％匀浆用低速离心机3000r/min离心10～15分钟，将离心好的匀浆留取上清液。取匀浆液备检，严格按一氧化氮、神经元型一氧化氮合酶、环鸟苷酸测定试剂盒的要求步骤操作。 结果： 1、仔鼠海马组织NO含量：各组组间NO含量差异有统计学意义；与对照组E相比，C、D组NO含量明显增加，差异有统计学意义，A、B组与E组差异无统计学意义。 2、仔鼠海马组织nNOS活性：各组组间nNOS活性有统计学意义；与对照组E相比，C、D组nNOS活性明显升高，差异有统计学意义，A、B组与E组差异无统计学意义。 3、仔鼠海马组织cGMP含量：各组组间cGMP含量差异有统计学意义；与对照组E相比，B、C、D组eGMP含量明显升高，差异有统计学意义，A组与E组差异无统计学意义。 结论： 实验结果显示不同剂量母源性BDE-209暴露能不同程度影响仔代大鼠海马组织一氧化氮、神经元型一氧化氮合酶、环鸟苷酸，提示NO神经信号递质，尤其NO/CGMP通路途径可能是一定剂量母源性BDE-209损伤仔鼠空间学习记忆能力的机制之一。 1、在大鼠神经系统发育的关键期，通过经口胃灌方法成功建立不同剂量母源性BDE-209大鼠慢性染毒模型，为仔代大鼠空间学习行为学研究及相关机制的探讨奠定了基础。此模型具有便于操作、成功率高和仿真程度好等特点。 2、一定剂量母源性BDE-209暴露可导致仔鼠的空间学习记忆能力障碍，且存在剂量效应关系。 3、一定剂量的BDE-209的母源性暴露可损伤仔鼠海马组织结构，这可能是其导致仔鼠神经系统损伤的基础，进而降低仔鼠空间学习记忆能力。 4、一定剂量母源性BDE-209暴露不同程度影响仔代大鼠海马组织ACH含量、ACHE活性、M-ACHR含量、N-ACHR含量，提示乙酰胆碱能神经递质是一定剂量母源性BDE-209损伤仔鼠学习记忆能力的可能机制。 5、一定剂量母源性BDE-209暴露不同程度影响仔代大鼠海马组织一氧化氮含量、神经元型一氧化氮合酶活性、环鸟苷酸含量，提示NO神经信号递质，尤其NO/CGMP途径是可能是一定剂量母源性BDE-209损伤仔鼠空间学习记忆能力的机制之一。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文缩略词对照表

声明

前言

第一部分不同剂量母源性BDE-209暴露对仔代大鼠空间学习记忆能力和海马组织结构的影响

材料与方法

结果

讨论

第二部分母源性BDE-209对仔代大鼠海马乙酰胆碱能神经递质的影响

材料与方法

结果

讨论

第三部分母源性BDE-209对仔代大鼠海马一氧化氮神经递质的影响

材料与方法

结果

讨论

全文小结

成果

参考文献

致谢

统计学证明