巨噬细胞移动抑制因子对细胞增殖、迁移、粘附的机理研究

摘要

动脉粥样硬化（AS）是动脉血管壁受损后的慢性炎症性疾病，尽管采取了积极的血管干预、控制血压以及调脂等治疗手段，目前仍是发病和死亡的主要原因。本研究通过RNA干扰技术特异性沉默MIF蛋白的表达并观察MIF对细胞增殖、迁移、粘附中所起的作用并探讨其作用机制。 第一部分、siRNA靶向MIF重组逆转录病毒载体构建及稳定表达细胞株的筛选。 目的：构建并鉴定MIF特异性siRNA重组逆转录病毒载体，将其导入phoenix细胞中，筛选出分泌MIF-siRNA病毒的包装细胞，进而鉴定该病毒上清可抑制MIF蛋白的表达。 方法： 1. pSuper．retroRNAi的设计及合成。 根据GenBank提供的MIF基因cDNA序列，所选择MIF的靶点序列分别为： pSRP/MIF-siRNA1 5'-CTATTACGACATGAACGCG-3' pSRP/MIF-siRNA2 5'-CAACTCCACCTTCGCCTAA-3 2. 逆转录病毒载体的构建。 将合成的正、反义链经过变性、复性后形成双链MIF基因siRNA，采用双链定向亚克隆入逆转录病毒载体SUPER．retro，转化大肠杆菌菌株E．coli DH5α，氨苄青霉素（100mg/L）筛选出阳性克隆，提取质粒。 3. 重组质粒MIFsiRNA的鉴定。 重组质粒用EcoRⅠ与HindⅢ酶进行双酶切，酶切产物行1%琼脂糖凝胶电泳。阳性克隆分别命名为pSRP/MIF1、pSRP/MIF2，纯化后测序鉴定。 4. 重组质粒转染包装病毒细胞株。 将包装病毒细胞phoenix接种到6孔板中，分别使用pSRP、pSRP/MIF1、pSRP/MIF2质粒各4μg，脂质体Lipofectamin200010μl/孔转染phoenix。转染后嘌呤霉素筛选3-4周获得阳性克隆。细胞株命名为phoenix-pSRP、phoenix-pSRP/MIF1 siRNA、phoenix-pSRP/MIF2 siRNA。 5. 重组逆转录病毒感染HeLa细胞株。 将筛选获得的phoenix阳性克隆培养至90%融合后换成无嘌呤霉素的完全培养基，24小时后收集细胞上清，滤液-70℃保存。HeLa细胞株接种到6孔板中，加入1ml phoenix细胞上清滤液并加入2μg/ml的聚凝胺，更换含嘌呤霉素的完全培养基筛选培养，约20天筛选完成。所产生的细胞株分别命名为HeLa-pSRP、HeLa-pSRP/MIF1 siRNA、HeLa-pSRP/MIF2 siRNA。 6. Western-blot检测MIF蛋白的沉默。 将筛选后的HeLa细胞株接种到6孔板中，培养生长至90%时，收集细胞。用细胞裂解液裂解，15%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白质转移到PVDF膜，用含5%脱脂奶粉的TTBS 37℃封闭1-2h，分别加入兔抗人MIF多克隆抗体（1：1000稀释），或小鼠抗人GAPDH单克隆抗体（1：1000稀释）4℃孵育过夜。TTBS漂洗5minx3次；兔抗辣根过氧化物酶标记二抗（1：5000稀释）37℃孵育1h； TTBS漂洗5 min×3次；SuperSignal Weste Femto敏感曝光试剂盒曝光底片显影。 第二部分、MIF在细胞生长、迁移、粘附中的作用研究。 目的：探讨MIF对细胞生长、迁移、粘附功能的影响和机制。 方法： 1. 细胞培养。 将HeLa-pSRP和HeLa-pSRP/MIF用含1μg/ml嘌呤霉素的完全培养基37℃5%CO2条件下培养，细胞生长至90%左右更换为完全培养基。将细胞消化至12孔板，起始细胞数为0．1×106/孔，连续计数6天。 2. 流式细胞仪检测HeLa-pSRP、HeLa-pSRP/MIF细胞周期及凋亡。 用Profile Ⅱ型流式细胞仪，在488nm激发波长下测定细胞DNA，用Multicycle软件分析细胞周期分布情况。 3. 细胞衰老试验。 HeLa-pSRP、HeLa-pSRP/MIF消化后将1×105 HeLa-pSRP、HeLa-pSRP/MIF细胞悬液分别进行细胞爬片，待细胞生长至80%左右进行实验。0．2%戊二醛固定5分钟后，加入X-gal混合液2ml/孔，放入温箱孵12小时，镜检，阳性细胞为出现蓝绿色。 4. 免疫荧光检测。 将HeLa-pSRP、HeLa-pSRP/MIF细胞分别消化成细胞悬液加已加盖玻片的6cm培养皿中，待细胞生长至70%后，去除培养液，PBS清洗3次，加入4%多聚甲醛溶液固定20分钟，后使用0．1%Triton X-100-PBS浸泡10分钟PBS/0．1%Triton X-100渗透10min，PBS洗涤3次，每次5min； 5%BSA封闭30min后加一抗：p53抗体（1：100稀释）4℃孵育过夜。PBS清洗3次，每次5分钟，5%BSA再封闭30 min；加二抗：加入Alexa Fluor 555 rabbit anti-mouse IgG（H+L）（1：1000稀释）Molecular Probe公司，室温孵育45分钟。PBS洗涤5次，每次5min（避光），加入DAPI（1：1000稀释）室温染核10分钟。PBS清洗1次，（避光）封片，在载玻片上滴一滴水溶性封片剂，然后将盖玻片（培养有细胞的一面朝向水溶性封片剂）从一侧轻轻粘在载玻片上，激光共聚焦显微镜扫描和照相。 5. 细胞迁移实验。 在Transwell下室的DMEM培养液中加入10%血清，在Transwell上室分别滴加1×105 HeLa-pSRP、HeLa-pSRP/MIF细胞悬液。将上室置于下室之中，在37℃温箱孵育。16 h后取出上室，用棉签将残留在上室内表面上的细胞拭去。上室经PBS洗涤后，用4%多聚甲醛固定迁移至上室外表面上的细胞，细胞用含0．1%龙胆紫的20%乙醇染色20分钟，用清水洗3遍，显微镜下（200×）计算迁移细胞数，结果取5个视野细胞计数的平均值。 6. 划痕试验。 HeLa-pSRP、HeLa-pSRP/MIF细胞铺6孔板中，当单细胞层生长至95%时，使用10μl枪头对细胞进行划痕。分别于0，24小时，36小时，48小时对细胞进行拍照，比较细胞划痕愈合的速度。 7. 细胞粘附性实验。 室温200μl/孔PBS洗涤2遍，胰酶消化HeLa-pSRP、HeLa-pSRP/MIF细胞，制成单细胞悬液，计数，调整细胞浓度为1×105/ml。每组分别设3个复孔，每孔加入100μl细胞悬液，37℃孵育1h后取出96孔培养板，用PBS洗涤2-3遍，去除未粘附细胞。含0．2%龙胆紫的10%乙醇染色5分钟，用PBS洗涤3-5遍，每孔加入100μl等体积混匀的0．1MNaH2PO4，PH4．5和50%乙醇以去除残余染色。酶标仪在波长570nm读数。 8. Western-blot检测。 将筛选后的HeLa细胞株接种到6孔板中，培养至每孔0．1×106时，收集细胞。用适量细胞裂解液裂解，上样，15%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白质转移到PVDF膜，用含5%脱脂奶粉的TTBS室温封闭1-2小时，分别加入兔抗人Cyclin D1、Bcl-2、Bax、FAK、AKT、ERK1/2、和ICAM-1多克隆抗体（1：1000稀释），鼠抗人p53、p21单克隆抗体1：800稀释，或小鼠抗人GAPDH单克隆抗体（1：1000稀释）4℃孵育过夜。TTBS漂洗5min×3次；兔抗辣根过氧化物酶标记二抗（1：5000稀释）37℃孵育1h； TTBS漂洗5 min×3次；SuperSignal Weste Femto敏感曝光试剂盒曝光底片显影。 统计方法： 使用SPSS17．0统计软件，两组数据比较采用两独立样本t检验，结果用平均值士标准差（x±S）表示，以P<0．05为有统计学差异。 论文小结： 1．成功构建了针对人MIF基因的siRNA重组逆转录病毒载体pSRP/MIF1、pSRP/MIF2。获得稳定抑制MIF表达的细胞株HeLa-pSRP/MIF和表达空载体的对照组细胞HeLa-pSRP。 2．沉默MIF后的HeLa细胞对TNF-α和放线菌酮诱导的凋亡减少，并且沉默MIF后细胞衰老减少。沉默MIF后细胞阻滞在G0/G1期，细胞生长减慢，迁移能力、粘附功能减弱。 3．本研究显示MIF通过影响cyclinD1、p53、p21表达维持细胞正常生长周期；MIF通过促进p53、p21的表达促进细胞衰老。另外，MIF通过增加Bax表达，促进细胞凋亡。MIF能促进细胞Src、FAK、ICAM-1、AKT、ERK1/2的表达，可能是MIF维持细胞的生长、移动、粘附特性的机制之一。 本文的创新点：通过HeLa细胞模型证实了MIF在细胞的生长、增殖、黏附、迁移过程中扮演重要作用及可能的分子机制。结合课题组早期的工作，这一创新性结果进一步揭示了MIF可能通过调节多种与细胞粘附、迁移有关的蛋白表达，促进动脉粥样硬化的发生、发展。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

前 言

第一部分siRNA靶向MIF重组逆转录病毒载体构建及稳定表达细胞株的筛选

1材料和方法

2结 果

3讨 论

4小 结

第二部分MIF对细胞增殖、迁移、粘附作用的研究

1材料和方法

2统计方法

3结 果

4讨 论

5小 结

全文总结

附图

参考文献

致谢

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统计学证明