LMP1/mCD99L2A20诱导小鼠A20细胞转化为H/RS样细胞的研究

摘要

淋巴瘤为免疫系统恶性肿瘤，其发生与机体免疫状况有着密切的关系，研究表明几乎所有HL伴有AIDS患者的H/RS细胞均有EBV的感染，提示HL的发生既与EBV感染密切相关，同时也伴有免疫功能缺陷。本研究拟将BALB/c小鼠经X线照射后，在降低其免疫功能的基础上，将所构建的表达LMP1的A20细胞以及表达LMP1同时低表达mCD99L2的LV-mCD99L2-A20克隆株皮下接种放射后的BALB/c小鼠，提高鼠类人H/RS细胞在BALB/c小鼠体内的成瘤率，观测鼠类人H/RS细胞在BALB/c小鼠体内的生物学特性、免疫表型和病理特征，从而建立鼠类人HL病理特征的动物模型。 目的: 1.构建含目的基因LMP1和报告基因copGFP的重组慢病毒表达载体，进行慢病毒包装和滴度测定。 2.不同方式转染鼠源性B淋巴瘤细胞株A20，探讨悬浮细胞A20最佳的转染方式，为本研究后续工作奠定基础。 3.将LMP1基因导入A20细胞和LV-mCD99L2-A20细胞，诱导其转化为H/RS样细胞，构建长期稳定表达LMP1基因和/或低表达mCD99L2基因的鼠类人H/RS细胞模型-LMP1+A20和LMP1+/mCD99L2-A20细胞。 4.构建LMP1+A20和LMP1+/mCD99L2-A20克隆株荷瘤裸鼠模型和BALB/c小鼠模型。 方法: 1.含目的基因LMP1的重组慢病毒表达载体的构建与鉴定以及慢病毒包装和滴度测定 根据慢病毒表达载体pCDF1-copGFP的多克隆酶切位点，设计特异性PCR引物，上下游分别引入BglⅡ和EcoRⅠ，以LMP1阳性质粒为模板，扩增目的基因LMP1全长，将之连接到慢病毒表达载体pCDF1-copGFP的多克隆酶切位点，转化大肠杆菌，挑选阳性克隆，经PCR扩增、质粒小量抽提、限制性酶切鉴定和测序鉴定重组载体pCDF1-LMP1-copGFP。在脂质体介导下将慢病毒包装系统的包装结构质粒pFIV、包膜质粒pVSVG和重组质粒pCDF1-LMP1-copGFP导入病毒包装细胞293FT，收集病毒上清，再用病毒上清转染293FT细胞，荧光显微镜观察293FT细胞绿色荧光的分布，高倍镜下对发荧光的细胞进行计数，根据SBI公司使用手册提供的公式计算病毒上清液的滴度（Tu/ml）：滴度=（稀释因子）×（绿色荧光细胞数/计数的细胞总数）×（被转染的细胞数）/0.5。 2.不同方式转染鼠源性B淋巴瘤细胞株A20的探讨 分别用传统的脂质体转染技术、新兴发展的NucleofectorTM核酸转染技术和慢病毒载体介导的转染技术，将重组慢病毒表达载体质粒pCDF1-LMP1-copGFP导入鼠源性B淋巴瘤细胞株A20，荧光显微镜观察A20细胞绿色荧光的分布，高倍镜下对发荧光的细胞进行计数，根据以下公式计算转染效率： 转染效率=（绿色荧光细胞数/计数的细胞总数）×100% 分析比较这三种技术转染悬浮细胞A20的转染效率，探讨A20细胞最佳的转染方式。 3.不同滴度慢病毒转染不同类型细胞转染效率的比较 将大容积包装的慢病毒上清液经低温超速离心浓缩，再分别用慢病毒上清液转染293FT、正常鼻咽上皮细胞和A20细胞，以及用浓缩后的慢病毒（107Tu/ml）分别转染293FT、L428和A20细胞，转染5d后，荧光显微镜下观察细胞内绿色荧光的分布，比较分析不同滴度慢病毒转染不同类型细胞的转染效率。 4.长期稳定表达LMP1基因和/或低表达mCD99L2基因的鼠类人H/RS细胞模型的构建与鉴定 采用经大容量包装和低温超速离心浓缩后的含目的基因LMP1的慢病毒转染A20细胞和LV-mCD99L2-A20细胞，有限稀释法筛选LMP1+A20单克隆和LMP1+/mCD99L2-A20单克隆细胞。光学显微镜和透射电镜下观察LMP1+A20单克隆和LMP1+/mCD99L2-A20单克隆细胞的形态特征；光镜下测试网格计数法动态监测大细胞（直径≥25μm）。RT-PCR和Western blot分别检测细胞内LMP1mRNA和LMP1蛋白的表达； MTT法检测细胞体外增殖能力；Transwell检测细胞的微侵袭能力；流式细胞仪检测细胞周期及细胞的免疫表型（CD19与CD30）。PCR检测LMP1+/mCD99L2-A20细胞内shRNA干扰载体的整合情况；RT-PCR及荧光定量PCR检测LMP1+/mCD99L2-A20细胞内mCD99L2表达水平。 5.LMP1+A20和LMP1+/mCD99L2-A20克隆株荷瘤裸鼠和BALB/c小鼠模型构建 分别将LMP1+A20和LMP1+/mCD99L2-A20克隆株皮下接种裸鼠成瘤，观察动物成瘤时间、成瘤率、皮下肿瘤生长速度；取裸鼠瘤块行石蜡包埋、制备病理组织切片、HE染色观察瘤细胞形态；免疫组织化学染色检测瘤组织内LMP1蛋白的表达；取瘤组织做原代培养，RT-PCR检测原代细胞内LMP1mRNA的表达；RT-PCR检测mCD99L2的表达水平；流式细胞仪检测原代瘤细胞CD19和CD30的表达。再分别将LMP1+A20和LMP1+/mCD99L2-A20克隆株皮下接种健康的和经X线照射（2Gy）后的同源BALB/c小鼠，做上述检测和鉴定；流式细胞仪检测正常BALB/c小鼠、接种瘤细胞成瘤和未成瘤小鼠外周血中淋巴细胞亚群的比例。 6.统计学处理 采用统计软件SPSS13.0对实验结果进行统计学处理和分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示。MTT法检测体外细胞增殖能力采用析因设计方差分析比较各组间差异。A20与各组细胞中H/RS样细胞数目的比较采用两因素方差分析（two-way ANOVA）比较组间差异。流式细胞仪检测细胞周期、肿瘤细胞CD抗原表达、外周血淋巴细胞亚群比例数据采用单因素方差分析（One-way ANOVA）比较组间差异，LSD多重比较各组间差异。Transwell法检测细胞体外微侵袭能力和两组之间成瘤时间的比较采用两独立样本t检验进行比较，两组之间成瘤率的比较采用X2检验。在体肿瘤生长曲线的比较采用重复测量方差分析方法处理，若球形检验P<0.05，拒绝球形检验，用Greenhouse-Geisser进行校正，采用校正后的F值和P值。 结果: 1.含目的基因LMP1的重组慢病毒表达载体的构建与鉴定以及慢病毒包装和滴度测定 （1）PCR扩增目的基因LMP1 所设计引物位于LMP1全外显子的上下游，包含起始密码子和终止密码子，扩增片段大小为1.2 kb。PCR产物的琼脂糖凝胶电泳见一清晰的特异性扩增条带，其大小与理论预期值相符。 （2）LMP1基因重组慢病毒表达载体pCDF1-LMP1-copGFP的构建和鉴定 将构建的LMP1基因重组慢病毒表达载体pCDF1-LMP1-copGFP的菌液经PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳可见1.2 kb的目的基因LMP1片段，小量抽提重组质粒，经EcoRⅠ和BglⅡ双酶切后，获得与目的基因LMP11.2kb一致的清晰条带，而空载体质粒上只有6671 bp的单一片段。 （3）DNA测序结果 取重组质粒进行DNA测序，结果表明我们所获得的LMP1片段与GenBank所公布的相应序列一致，无碱基缺失及错误。 （4）慢病毒包装及滴度测定结果 用脂质体将己构建的慢病毒载体系统中3种质粒成分导入病毒包装细胞293FT中，荧光显微镜下见大量绿色荧光，证实已有大量质粒转入293FT细胞，绿色荧光位于细胞的胞膜及胞浆，这与LMP1的表达位置一致。取病毒上清液转染293FT细胞，荧光显微镜下观察细胞内绿色荧光的分布，测定病毒上清液的滴度为1.6×105Tu/ml。 2.不同方式转染鼠源性B淋巴瘤细胞株A20 3. 慢病毒上清液转染 4.长期稳定表达LMP1基因和/或低表达mCD99L2基因的鼠类人H/RS细胞模型的构建与鉴定 5.LMP1+A20和LMP1+/mCD99L2-A20克隆株荷瘤裸鼠模型的构建与鉴定 6.LMP1+A20和LMP1+/mCD99L2-A20克隆株BALB/c小鼠模型的建立 结论: 1.高滴度慢病毒表达载体可高效转染小鼠B淋巴瘤细胞A20，较脂质体转染法和NucleofectorTM核酸转染法有明显的优势。 2.将LMP1基因导入A20细胞和LV-mCD99L2-A20细胞，能诱导A20细胞转化为H/RS样细胞，建立了长期稳定表达LMP1基因和/或低表达mCD99L2基因的小鼠H/RS样细胞模型。 3.将LMP1+A20和LMP1+/mCD99L2-A20克隆株分别皮下接种裸鼠和经X线照射后的BALB/c小鼠，建立了LMP1+A20和LMP1+/mCD99L2-A20克隆株荷瘤裸鼠模型和BALB/c小鼠模型，后者出现了淋巴细胞、浆细胞和组织细胞等背景细胞，类似人cHL的病理特征。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写与注解

声明

前言

技术路线

第一章 LMP1基因重组慢病毒表达载体的构建

一、材料和方法

二、结果

三、讨论

参考文献

第二章 不同方式转染小鼠B淋巴瘤细胞A20的探讨

一、材料和方法

二、结果

三、讨论

参考文献

第三章 LMP1+／mCD99L2-基因的小鼠H/RS样细胞模型的建立

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

参考文献

第四章 LMP1+A20和LMP1+／mCD99L2-A20克隆株荷瘤裸鼠及BALB／c小鼠模型的构建

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

参考文献

全文总结

攻读学位期间研究成果

致谢

统计学审稿证明