Peutz-Jeghers综合征STK11基因胚系突变及STK11、TGFβ1蛋白表达研究

摘要

Peutz-Jeghers综合征（PJS）是一种以皮肤粘膜黑斑、胃肠道多发息肉为特征的常染色体显性遗传病[1]。Hemminki和Jenne几乎同时在PJS患者和家系中发现STK11（serine threonine kinase11，丝氨酸/苏氨酸激酶11）基因胚系突变，证实该基因为本病的主要致病基因。胚系突变与遗传相关，在血液DNA水平即可发生。研究表明，大多数PJS患者存在STK11基因突变，突变形式以点突变和小片段缺失为主，预期效应是提前出现终止信号，产生截短型蛋白、导致蛋白激酶失活[2'3]。目前发现STK11（亦称LKB1）蛋白在染色质重构、细胞周期、细胞极性以及能量代谢的应答调控等方面发挥重要作用，对包括TGFβ/smad通路、NF-κB信号通路、PTEN/磷脂酰肌醇3'磷酸激酶信号通路、G蛋白偶联信号通路在内的多条通路发挥了调节作用。此外，STK11蛋白能抑制细胞的增殖，促进凋亡。其表达水平的降低，可导致体细胞其它肿瘤相关基因突变的累积，最终致恶性肿瘤的发生。 TGFβ（转化生长因子β）是一种由二硫键连接的多肽二聚体，其家族成员在哺乳动物体内具有相当高的稳定性。在机体内TGFβ可规律地控制上皮细胞的生长，间接修复DNA损伤，激发细胞凋亡，调节干细胞功能，具有致癌及抑制肿瘤的双重特性。TGFβ/Smad通路是TGFβ信号转导的主要途径，TGFβ与其受体形成受体复合物，激活Smad蛋白，将信号转导至细胞核，行使转录因子的功能。TGFβ对不同的细胞有不同的效应，对于成纤维细胞，它的主要作用是刺激细胞分裂；而对于大多数上皮细胞，却起生长抑制作用。近年来，大量文献报道TGFβ信号通路的异常与肿瘤的发生、发展及转移等密切相关。该通路中任一元件的异常都可引起信号转导紊乱，使细胞逃避TGFβ介导的生长抑制效应，导致肿瘤发生。人类TGFβ家族包括TGFβ1、2、3，三者高度同源，其基因分别位于19q13、1q41、14q24。TGFβ1是细胞和组织中最丰富的TGFβ成员，由于其启动子的调控复杂，其失控导致的疾病，包括肿瘤的形成也是最为多见。TGFβ1具有抑制细胞生长的负调节生物学效应，其表达或激活方面的缺陷可导致生长抑制作用消失和细胞恶性增殖。 Ki67（增殖细胞核抗原）是目前较为肯定的核增殖标志，开始表达于细胞周期的G1期，S期及G2期表达增加，M期达高峰，在分裂晚期很快消失，G0期无表达。Ki67半衰期短，脱离细胞周期后迅速降解。其表达量的变化可较客观反映肿瘤的增殖活性。 国外最新研究表明，STK11基因等位缺失的PJS模型老鼠，胃肠道错构瘤息肉间质TGFβ信号缺陷，进而引起间质邻近的腺上皮细胞的增殖活跃，在野生型（无STK11缺失）老鼠胃肠粘膜则未发现此特点。研究者进而提出“STK11表达缺失→TGFβ信号调低→腺上皮过度增殖→促进PJ息肉形成”学说，认为人PJ息肉的形成与TGFβ信号的异常有密切关系。该学说为探索PJ息肉的形成机理提供了新的思路。 目的: 1.对PJS患者及家系STK11基因的胚系突变进行筛查，分析突变类型及可能的致病突变，探讨国人PJS家系STK11基因胚系突变的特点。 2.检测STK11及TGFβ1蛋白在PJ息肉组织上的表达，结合对PJ息肉增殖活性的研究，从组织蛋白水平对“STK11缺失→TGFβ信号调低←腺上皮过度增殖→促进PJ息肉形成”学说进行初步验证。材料与方法 1.PJS家系20例为实验组（其中患者16例，家族正常人4例），随机选择与PJS家系无关的健康人20名做为对照组，两组均抽取外周血5ml，提取基因组DNA。针对人类STK11基因全部九个外显子分别设计引物，PCR扩增后纯化回收产物，DNA直接测序法检测STK11基因胚系突变情况，NCBI在线BLAST比对初步筛查，阳性者分别与家系健康人及正常对照组比较，分析PJS家系STK11基因胚系突变特点。 2.PJ息肉石蜡标本23例（来自11名患者胃肠道不同部位息肉）为实验组，正常胃肠粘膜组织10例为对照组。免疫组化SP法检测STK11、TGFβ1及Ki67蛋白表达部位及阳性率，阳性率以染色标记指数（Labeling index，LI）表示。另外选取结肠腺瘤标本12例、结肠癌标本11例，同法检测TGFβ1和Ki67蛋白表达部位及阳性率。 3.采用SPSS13.0统计软件进行统计学处理。原始数据如满足参数检验条件，两独立样本均数比较用t检验；多组独立样本均数比较采用方差分析（F检验）；双变量相关性分析采用Pearson积差相关分析。如不满足参数检验条件，两独立样本差异比较采用Mannn-Whitney U检验；多组独立样本比较采用Kruskal-Wallis H检验；双变量相关性分析采用Spearman秩相关分析。以双侧α=0.05作为检验水准。检验标准以P<0.05为有显著性差异或有显著相关关系。 结果: 1.实验组20例共有15例发现STK11基因外显子序列的突变，形式均表现为点突变（错义突变），预期效应是引起编码蛋白异常。对照组未发现外显子序列的碱基突变。突变分布于基因的第4号、6号及8号外显子。发现家系A中，三名患者有第8外显子354号密码子GAA→CAA杂合性突变，一名家系健康人无此突变，正常对照组未发现此突变。此外检测到多名患者第4外显子154、155、176及第6外显子270位密码子的错义突变。 2.正常胃肠粘膜上皮及间质细胞均表达STK11蛋白，为胞浆及胞核染色。PJ息肉STK11蛋白主要有三种表达类型：①上皮细胞表达降低、间质细胞表达缺失；②完全表达缺失；③类似正常粘膜表达。正常胃肠粘膜上皮及间质细胞表达TGFβ1蛋白，浆染为主，无核染。PJ息肉间质细胞表达为主，部分有上皮细胞染色，无核染。腺瘤及腺癌组织TGFβ1表达增强，胞浆、膜、核均着色，间质表达增强。Ki67为特异性胞核染色，在PJ息肉、正常组织中表达低于腺瘤、腺癌组织。 3.经Mann-Whitney u检验，PJS息肉STK11蛋白LI平均秩为13.5，正常组为25.05，u=34.500，P=0.002<0.05，二者有显著性差异，PJ息肉较正常粘膜低表达STK11蛋白。PJS息肉TGFβ1蛋白LI平均秩为14.61，正常组22.5，u=60.000，P=0.031<0.05，二者有显著性差异，PJ息肉较正常粘膜低表达TGFβ1蛋白。采用Krus kal-Wallis H检验比较PJ息肉、正常胃肠组织、结肠腺瘤及结肠腺癌四组间Ki67的LI差异，四组平均秩依次为18.43、15.75、37，79、51.0。X2=39.711，P=0.000<0.05，四组间有显著性差异，根据平均秩次，结肠癌组Ki67表达最高，其后依次是结肠腺瘤组、PJS组、正常组。 4.Spearman秩相关分析PJ息肉标本STK11与TGFβ1的LI相关性，相关系数rs=0.863，P=0.000<0.05，二者有显著正相关关系。同样做TGFβ1与Ki67的LI秩相关分析：rs=-0.422，P=0.045<0.05，二者呈显著负相关关系。正常胃肠组织、结肠腺瘤及结肠腺癌TGFβ1、Ki67的LI相关性分析用Pearson积差相关进行分析，相关系数r依次为0.216、0.349、0.095，P值依次为0.549、0.266、0.782，P值均大于0.05，无显著相关关系。 结论: 1.PJS家系存在多个STK11基因胚系突变位点，提示STK11基因胚系突变与PJS密切相关。STK11基因第8外显子354密码子GAA→CAA错义突变与A家系PJS致病相关。第4外显子154、155、176，第6外显子270密码子的错义突变可能是相应PJS家系的致病突变。 2.PJ息肉表达STK11蛋白降低，提示该蛋白的功能对抑制息肉形成可能起关键作用。表达TGFβ1蛋白降低，提示TGFβ信号异常可能与PJ息肉形成有关。PJ息肉组织增殖活性稍高于正常粘膜组织，低于腺瘤及腺癌组织。 3.PJ息肉STK11蛋白功能失活可能引起TGFβ1蛋白低表达，进而增强上皮组织增殖活性（表现为Ki67表达增高）。免疫组化结果一定程度支持了“STK11表达缺失→TGFβ信号调低→腺上皮过度增殖→促进PJ息肉形成”学说。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

前 言

第一章 Peutz-Jeghers综合征STK11基因胚系突变检测

第一节材料与方法

第二节结果

第三节讨论

第二章 STK11、TGFβ1蛋白表达与Peutz-Jeghers息肉增殖活性的相关性研究

引言

第一节材料与方法

第二节结果

第三节讨论

第三章Peutz-Jeghers综合征伴多器官恶性肿瘤患者临床研究

全文总结

参考文献

硕士期间发表论文

致谢

统计学证明