高效液相色谱法测定脊柱结核中抗结核药物浓度的研究

摘要

研究背景:
　　 结核病是一种古老的传染病,也是伴随人类历史最长的疾病之一,1904年在德国Heidelberg附近出土的新石器时代(公元前5000-10000年)人的颈椎骨化石,被发现已有结核病变的存在。18世纪中叶,英国伦敦的结核病死亡率高达900/10万,迄今全世界因结核病而死亡的人数已达2亿。结核病被称为“白色瘟疫”,战争和贫穷更是“雪上加霜”,加速了结核病的传播和病人的死亡,在人类历史上演绎了一幕幕的悲剧。至今结核病仍然是发展中国家最严重的传染病之一,在我国的历史上这个所谓的“痨病”曾经夺走了无数劳动者的生命。新中国建立以前,民间更有“十痨九死”之说,可见当时结核病的猖獗以及老百姓对结核病造成的恐怖。直到链霉素等抗痨药的相继问世,再加上解放后政府对结核病防治工作的重视,全国范围内相继成立了结核病疗养院,防治所和研究所。我国骨科先辈方先之先生率先开展的“骨关节结核病灶清除术”使骨关节结核和脊柱结核的治愈率有了很大的提高。20世纪70年代以后,随着我国改革开放经济建设取得了很大成就,国民生活水品大幅度提高,结核病病死率及感染率急剧下降,病例减少,导致一些结核病防治部门相继关门下马,或改为其他医疗单位。然而近十年以来随着HIV感染和免疫系统疾病患者的增加,加之空气污染,人们对结核病的防范意识淡薄等因素,使结核病呈全球性的“死灰复燃”的趋势。目前全世界结核病患逾2000万,每年新增近800万,1993年WHO宣布了“全球进入结核病紧急状态”。目前在我国结核病人数居世界前位,居于所有传染病的第一位。其中骨关节结核是主要的肺外结核之一,当前全国估计有骨关节结核病人30万左右,曾经销声匿迹的“痨病”已经再现人间,加之抗结核药物耐药性呈增加趋势,这都向广大医务工作者和骨科工作者敲响了警钟和提出了新的要求。
　　 脊柱结核的外科治疗,作为脊柱结核整个治疗过程中的一个阶段。在抗痨药物的基础上,实施外科手术清病灶,可以直接切除病椎并有利于抗结核药物渗入病灶,缩短疗程,提高治愈率。手术中一方面对结核病灶清除越彻底复发率相对越低,另一方面手术创伤也越大,手术时间出血量也随之曾加,术后并发症也越多。能不能明确的掌握病灶清除术中病椎应切除的范围是广大外科医生非常关心的一个问题,然而对抗痨药物在脊柱结核病椎中的分布情况却至今鲜有报道,这对病椎切除范围的划定带来了一个难题。本文采用高效液相色谱技术(HPLC)探索出在一个色谱条件下同时检测出三种抗结核药物浓度,分离效果满意,各峰与血液中内源性物质互不干扰,方法学考察适于人体内生物样品的分析,用于临床血药浓度监测和生物等效性评价。并借此检测方法对脊柱结核患者血液,髂骨,病椎,及病椎外亚健康骨中的异烟肼(INH),利福平(RFP)和吡嗪酰胺(PZA)三药的浓度进行了全面检测。探讨正规化疗后抗结核药物在脊柱结核患者病椎中的分布情况,为脊柱结核病灶清除术划定手术切除的范围和术后化疗方案的调整提供理论依据。
　　 目的:研究脊柱结核正规化疗后抗结核药物在病椎内外分布的特点。为脊柱结核病灶清除术划定手术切除的范围和术后化疗方案的调整提供理论依据。
　　 方法:
　　 一.研究对象:
　　 选取我科应用2SHRZ/6H2R2Z2短程化疗方案[5]结合手术治疗的初治脊柱结核患者28例。男16例,女12例；年龄23-71岁,平均36.5岁；颈椎3例,胸椎8例,胸腰椎5例,腰椎10例,腰骶椎2例。28例患者均具备手术指征,包括脊髓受压神经功能减退,椎体塌陷变形或脊柱后凸畸形,椎旁巨大冷脓肿或对非手术治疗效果欠佳等。全部患者肝肾功能均正常,初治涂阴患者,平均体重57.1kg.全部病例入院后按照2SHRZ/6H2R2Z2方案化疗,每日晨督导直视下顿服药物,剂量为INH 0.3、RFP 0.45、SM 0.75、PZA1.5正规抗结核治疗4周,待结核中毒症状减轻,血沉<60mm/h或血沉呈持续下降趋势,血红蛋白>100g/L后行手术治疗。术前先行CT检查了解病椎情况,28例患者中15例病椎无硬化骨归入非硬化骨组(图1),13例含有病椎硬化骨归入硬化骨组(图2)。测量病灶,硬化壁,亚健康骨和正常椎骨的CT值。28例脊柱结核患者当中,24例椎体前柱破坏严重,并存在椎旁脓肿,采用侧前方入路经胸(胸椎)或经腹膜后间隙(腰椎)实施病灶清除加内固定术。4例病变集中在椎体后部,椎体前方无明显脓肿,干酪样坏死及死骨,或者存在严重腰痛和神经损伤症状,采用后入路病灶清除植骨,经椎弓根内固定术
　　 二.实验室检测
　　 1.样本采集:患者术晨统一空腹服药并记录时间。术中取患者血液,病灶,“亚健康骨”(即病灶周围肉眼观察正常的骨组织),髂骨。因脊柱结核病灶周围“亚健康骨”的概念较为模糊,目前尚无统一标准,为进一步探索脊柱结核抗结核药物在病灶周围骨骼中的分布情况,将“亚健康骨”进行分段检测。临床病理学研究证实,病灶周围4mm范围内的亚健康骨中仍然存在微小病灶[4],故亚健康骨按病灶边缘4mm范围内外划界,距病灶周围4mm范围以内的“亚健康骨”划为A段“亚健康骨”,距病灶周围4mm范围以外的“亚健康骨”划为B段“亚健康骨”。术中用骨孔测探器尾部刻度测量后分别取A,B两段(图3)。每次取样时间严格控制在服药后2小时以内,以保证各药血药浓度达到峰值,提高检出率。
　　 2.样品预处理:静脉血样本(5ml)置于肝素抗凝玻璃试管(每管加Vc 1 mg抗氧化),4000转/min离心15min得血浆,再转入EP管,置-70 C0冰箱中待测。病椎及髂骨用滤纸拭血后称重(质量均大于0.5 g),置-200 C0液态氮下冷冻后迅速将其取出研磨成粉,置于-50 C0避光下冷冻干燥,再称重并计算组织样本的干湿重量比。分析天平精确称取200 μg,加入甲醇提取液2 ml涡旋10分钟后离心,取上清液制成骨组织提取液。取出骨组织提取液1 ml放入EP管中留待测定其中的血红蛋白(HB)含量。
　　 3.检测色谱条件:色谱柱为分析柱shim-pack BRC-C8(250mm×4.6mm,5μm),保护柱Eclipse XDB-C18(125min×4.6mm):流动相为0.02mol/L,庚烷磺酸钠溶液(稀磷酸调pH至3.0)-乙腈-甲醇(78:5:17)6min,(20:5:75)16min,(78:5:17)27min.流速:0.8ml/min,测试紫外线光波波长为:PZA:268nm,INH:264nm,RFP:254nm三种抗结核药物的保留时间分别为:PZA:5.62min,INH:10.01min,RFP:24.89min.建立标准曲线:将空白血浆加入标准品溶液稀释成含INH、RPF、PZA分别为0.1、0.2、0.4、1、2、4、8、16μg/ml的标准血浆。
　　 样本统计分析:
　　 采用spss 13.0统计学软件,各组实验数据以(X)±S表示,样本经spss统计分析,Levene检验方差齐性,实验结果数据方差齐性,one-way ANOVA作方差分析,多样本均数比较采用Dunnet-t检验,α=0.05。Levene检验方差不齐,采用welch校正后作方差分析,多样本均数比较采用Dunnet-T3检验,α=0.05。
　　 1.血液样本测试结果INH、RPF、PZA血药浓度与文献报道健康人单次服药的药时数据相近,各例药血药浓度高于髂骨、“亚健康骨”及病椎组织中的药物浓度,因各药物血药浓度远高于各药最低杀菌浓度(10倍MIC),故未与其他样本作方差分析比较.
　　 2.硬化骨病例测试结果
　　 含有硬化骨的13例病灶部分INH、RFP未能测出药物浓度,PZA浓度相对较高。髂骨,A段亚健康骨和B段亚健康骨中抗结核药物浓度总体方差具有统计意义INH(F=17.097 P<0.01)、RFP(F=9.018 P<0.05)、PZA(F=22.510 P<0.01)。A段亚健康骨药物浓度比髂骨中药物浓度低,INH:两者差异有统计学意义(P<0.01),RFP:两者差异有统计学意义(P<0.01),PZA:两者差异有统计学意义(P<0.01)。B段亚健康骨药物浓度与髂骨药物浓度接近,INH:两者差异有统计学意义(P<0.05),RFP:两者差异无统计学意义(P>0.05),PZA:两者差异无统计学意义(P>0.05)
　　 3.非硬化病例测试结果
　　 不含有硬化骨的15例病例,髂骨,A段亚健康骨和B段亚健康骨中抗结核药物浓度总体方差不具有统计意义INH(F=2.290 P>0.05)、RFP(F=2.903 P>0.05)、PZA(F=1.223 P>0.05)
　　 4.两组病灶中的药物浓度
　　 三种药物远低于各药物最低抑菌浓度(MIC),特别在硬化骨组中的INH和RFP未能检测出药物浓度,仅PZA能测出极低的药物浓度,故对病灶中的药物未统计学分析。
　　 结论:
　　 一.在脊柱结核病灶中抗结核药物浓度低于最低抑菌浓度,手术时应部分切除。
　　 二.含有硬化壁的病灶周围4mm范围内“亚健康骨”中药物浓度仍然较低,手术时可考虑部分切除；不含有硬化壁的病灶周围4mm范围内亚健康骨中药物浓度相对较高,手术时可予以保留。
　　 三.硬化壁内药物浓度极低,手术时应彻底清除。硬化壁可能是阻挡药物渗进一步透到病灶中的因为。
　　 四.三种抗结核药物中PZA在血液和骨骼中浓度最高,有一定的渗透性；RFP在血液中浓度较高,在骨骼中其次；INH浓度在血液及骨骼中浓度均最低。

目录

文摘

英文文摘

前言

高效液相色谱法测定脊柱结核中抗结核药物浓度的研究

1.材料与方法

2.结果

3.结论

4.讨论

参考文献

文献综述

参考文献

全文小结

缩略词汇表

攻读硕士学位期间取得成绩

致谢

统计学合格证明