表没食子儿茶素没食子酸酯对酒精性肝病小鼠铁过载的作用和机制研究

摘要

研究背景及目的:
　　 酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)是因长期、大量饮用各种含乙醇的饮料所致肝脏损害性病变,在组织病理学上主要表现为四种形式:酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、肝纤维化、肝硬化。ALD是全世界范围内倍受关注的公共卫生问题。ALD的发病机制复杂,涉及酒精及其代谢产物对肝脏的直接和间接损伤,同时还与营养状态及遗传易感性密切相关。大量证据表明,氧化应激在酒精性肝病的发病中起着重要作用,氧化应激由产生过多的自由基(超氧化物,过氧化物,羟自由基)引起,可加速内在抗氧化剂(谷胱甘肽,维生素A、C和E)的消耗或两者同时发生。几种内源性自由基的来源,包括线粒体,黄嘌呤氧化酶,
　　 细胞色素P4502E1(CYP2E1),脂质加氧酶和Fe2+,已经在慢性酒精摄入的动物肝脏中被证实。铁通过催化超氧化物和过氧化氢转变为更强有力的氧化剂,如羟自由基或高铁自由基,或超高铁自由基的Fenton反应而引起氧化应激。这些强有力的自由基.通过脂质过氧化反应及蛋白和DNA氧化引起组织损伤。大量证据表明,铁在酒精性肝病中起着重要作用。在慢性消耗的酒精依赖个体中,平均肝铁浓度大量增加,而且在酒精性肝硬化的患者中,肝铁摄取率增加。
　　 对ALD的治疗目前尚缺乏特效手段,所用研究药物因副作用大而不能广泛应用于临床,因此主要采用支持疗法,予高蛋白、高维生素、低脂饮食,补充复合氨基酸、维生素类、微量元素锌,维持电解质及液体平衡等及对症治疗。铁是生物体内最重要的脂质过氧化反应促进剂,铁可启动或催化Haber-weiss反应,产生自由基破坏肝细胞的细胞器(主要是对溶酶体膜的破坏),最终造成肝细胞死亡。而肝细胞的死亡又会进一步加重肝铁过载,因为肝细胞坏死后,肝细胞浆内的铁蛋白会被溶酶体消化,放出不溶性的含铁血黄素,由此形成恶性循环。在这一过程中酒精和铁对肝脏具有协同的损害作用。我们认为打破这个恶性循环的关键是改善或消除肝铁过载。
　　 绿茶作为传统饮料的代表有利于人体健康。茶多酚、儿茶素是绿茶的主要成分,它是一种多酚化合物,主要的儿茶素包括表儿茶素(Ec)、没食子酸表儿茶素(ECG)、表没食子酸儿茶素(EGC)和没食子酸表没食子酸儿茶素(EGCG),其中EGCG含量最高,占儿茶素的50％左右。EGCG作为茶多酚的主要单体及活性成分,具有许多重要的生物功能,如抗氧化、抗炎、铁螯合及抗癌等作用的发挥主要依赖于EGCG。研究表明EGCG对铁超载引起的机体损伤表现出良好的保护作用,这种作用可能主要是通过以下两个方面来完成的:①抗氧化；②螯合金属铁离子。大量实验证明,EGCG可以和铁参与的氧化体系中的铁离子发生作用,从而达到抑制氧化反应的产生。
　　 然而,关于茶多酚对酒精性肝病铁代谢异常的作用目前国内外尚无报道。因此,本研究拟通过酒精灌胃建立ALD小鼠模型,以腹腔注射给予EGCG的方式,采取小鼠血清及肝组织标本,比较不同剂量EGCG作用下的小鼠肝脏病理变化、血清ALT,AST水平、血清铁,肝铁含量及肝组织SOD活性、MDA含量与模型组小鼠之间的差异,观察其对ALD小鼠模型的保护和治疗作用,采用Real-timePCR、Western blot等方法研究EGCG对ALD小鼠肝脏铁代谢相关因子HepcidinmRNA及Tf、TfR1蛋白表达的作用,从分子水平探讨EGCG治疗ALD铁过载的作用机制。
　　 材料与方法:
　　 6～8周龄雄性SPF级C57BL6小鼠70只,体重21±2g。购回后饲养于恒温,恒湿条件下自由摄取食水,饲养一周左右开始实验。随机分为正常组(12只)和模型组(58只)。模型组小鼠每日予酒精灌胃,酒精剂量开始为4g/kg.d(溶液最大酒精含量为52％),计算方法为:酒精重量(g)=白酒体积(ml)×白酒酒精含量(v/v)×酒精密度(0.8/ml),5周内酒精剂量逐渐增加到6g/kg.d,持续该剂量继续喂养7周。正常对照组小鼠以等体积生理盐水灌胃。8周末取正常对照组,模型组动物各4只,剖杀,取血及肝脏组织,通过肝组织病理学及血清ALT、AST变化以确定模型建立是否成功。
　　 模型组小鼠于造模第9周随机分为5组,每组10只。即模型组；模型组+EGCG 10mg/kg组；模型组+EGCG 20mg/kg组；模型组+EGCG 30mg/kg组；模型组+去铁胺200mg/kg组(阳性药物组)。药物均为腹腔注射给药,正常对照组予等体积生理盐水腹腔注射,每日一次,持续4周。实验至第12周末,小鼠禁食24h,剖杀,留取血及肝组织备检。血标本送检珠江医院检验科检测血清ALT、AST及血清铁含量。将取材后的肝组织固定于4％多聚甲醛溶液,石蜡包埋,5μm切片行HE染色,光镜下观察肝组织病理形态变化。另取肝组织制备10％组织匀浆,按试剂盒操作检测肝组织蛋白含量、SOD活性及MDA含量。剩余肝组织置低温冰箱-80℃冷冻保存,以Real-time PCR方法检测Hepcidin mRNA表达水平,以Western blot印迹分析Tf和TfR1蛋白表达水平。
　　 结论:
　　 1.应用逐渐增加酒精浓度和剂量灌胃的方法可以成功制作小鼠ALD模型,该模型肝脏病变可反映临床酒精性肝病的基本病变。
　　 2.ALD发病过程中存在铁过载,铁过载参与了ALD的发病过程,Hepcidin mRNA表达水平的下调及Tf、TfR1蛋白表达水平失衡可能是促进病情进展的重要因素之一。
　　 3.EGCG显著降低了脂质过氧化反应的终产物MDA的含量,提高了抗氧化剂SOD的活性,促使氧化与抗氧化机制恢复平衡,同时也降低了肝脏转氨酶水平,使肝脏组织学明显改善。
　　 4.EGCG对小鼠ALD铁过载具有明显的治疗作用。其作用机制可能与其调节脂质代谢,抗氧化,上调Hepcidin的表达抑制小肠对铁的吸收,以及下调Tf、TfR1蛋白的表达抑制肝细胞对铁的吸收有关。从分子水平揭示了EGCG治疗ALD铁过载的作用机理,为临床治疗ALD提供了新的途径。

目录

文摘

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前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述 酒精性肝病与铁代谢紊乱

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