地贫Pesaro危险分级对应的铁过载小鼠模型的建立方法

摘要

本发明公开了地中海贫血Pesaro危险分级所对应的铁过载小鼠模型的建立方法，该方法包括以下步骤：给实验小鼠腹腔注射含铁制剂，剂量为每kg体重的小鼠1g铁，每周给铁1次，所述的铁包括Fe2+和Fe3+；小鼠给药1周后可建立Pesaro危险分级中的I级铁过载小鼠模型；给药2-4周可建立Pesaro危险分级中的II级铁过载小鼠模型；给药5-8周可建立Pesaro危险分级中的III级铁过载小鼠模型。本发明的给药间隔符合地贫患者反复输血逐渐引起的铁过载而诱发的肝肿大和肝纤维化的病理进程；同时可避免短时间大剂量给铁而引起的小鼠急性铁剂中毒死亡，或给铁间隔过长而使小鼠的造模时间过久。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及地中海贫血Pesaro危险分级所对应的 铁过载小鼠模型的建立方法。

背景技术

地中海贫血(简称地贫，thalassemia)是一种珠蛋白肽链(α、β链)合成 障碍性贫血，属于常染色体遗传病。因为早期的病例均来自于地中海地区，故 称为地中海贫血或海洋性贫血。以后逐渐发现这种疾病广泛分布于全球热带和 亚热带地区，我国长江以南各省区也是该病的高发区，特别是广东、广西、海 南更为常见。据WHO估计，全世界约有3.45亿人是地中海贫血的携带者，其 中包括8,000～9,000万的β-地贫携带者。我国南方地贫高发区重症地贫患儿的出 生率高于全球的平均出生率，重型β地贫和中间型β地贫总的发生率约为 0.2-1.0‰。

重型β地贫是一种进展性疾病，骨髓移植被认为是目前治愈重型β地贫的唯 一方法，而预处理是骨髓移植的重要环节之一。大多数移植中心采用以白消安/ 环磷酰胺为基础的移植预处理方案，其主要目的是：①根除异常的骨髓造血干 细胞，最大限度减少复发，同时为异基因造血干细胞的植入提供空间；②破坏 患者免疫系统，为异基因造血干细胞的植入提供条件，防止移植物被排斥。

预处理方案中所用白消安和环磷酰胺的剂量通常与地中海贫血患者的危险 分级相关。意大利的Pesaro通过对地贫骨髓移植预处理方案完全相同的年龄小于 17岁的161例地贫骨髓移植治疗效果进行多元回归分析，发现：肝肿大超过2cm、 肝脏纤维化和不正规使用去铁胺为三个危险因素，会显著地降低了移植后的生 存率。正规使用去铁胺被定义为开始输血后18个月内使用和皮下注射8-10小时、 每周至少5次。这样，Pesaro将地贫患者分成3个危险等级：I级，3个危险因素 均没有；II级，有1-2个危险因素；III级，3个危险因素均有。文献报道，Pesaro 危险分级中，I级和II级患者使用14mg/kg的白消安及200mg/kg的环磷酰胺处理， 而III级患者使用低剂量的环磷酰胺(120-160mg/kg)。广东南方医院儿科的李春 富则根据患者危险级别的不同，同时调整白消安和环磷酰胺的剂量。

预处理方案中所用白消安和环磷酰胺的剂量若过大，会引起不良反应，导 致病人死亡；剂量若不足，则引起移植排斥或复发。为了提高β地贫骨髓移植 的成功率，迫切需要揭示地中海贫血患者的危险级别与预处理用药剂量之间的 内在关系，为不同危险级别的患者制定个性化的预处理方案。地贫Pesaro危险 分级的肝肿大、肝纤维化和不正规使用去铁胺的三个危险因素，主要是由于地 贫患者反复输血导致的体内铁过载引起的，因此建立地中海贫血Pesaro危险分 级所对应的铁过载小鼠模型，就成为研究地贫危险级别与预处理用药剂量之间 内在关系的首要基础任务。

发明内容

本发明的目的在于提供地中海贫血Pesaro危险分级所对应的铁过载小鼠模 型的建立方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

地中海贫血Pesaro危险分级所对应的铁过载小鼠模型的建立方法，包括以下 步骤：

给实验小鼠腹腔注射含铁制剂，剂量为每kg体重的小鼠1g铁，每周给铁1 次，所述的铁包括Fe²⁺和Fe³⁺；

小鼠注射1周后可建立地中海贫血Pesaro危险分级所对应的I级铁过载小鼠 模型；

小鼠注射2-4周可建立地中海贫血Pesaro危险分级所对应的II级铁过载小鼠 模型；

小鼠注射5-8周可建立地中海贫血Pesaro危险分级所对应的III级铁过载小 鼠模型；

所述的含铁制剂优选右旋糖酐铁、枸橼酸铁铵、蔗糖铁或复合葡萄糖酸钠铁；

实验小鼠的饲养参照一般SPF级实验动物的饲养即可；具体为：饲养环境 20-26℃、相对湿度40-70％，设定光照/黑暗为12h/12h昼夜循环；常规饲料，自 由进食、进水，1周换2-3次垫料。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明选用腹腔注射给药，和在饲料中添加铁剂饲喂比较，可防止饲料 加工过程中的铁剂变化，还可保证剂量准确；和灌胃比较，更符合国际动物伦 理学的要求；同时可以避免铁剂口服而导致的胃肠刺激性损伤。

2、本发明选用给铁剂量为1g/kg体重，和小剂量的多次给药相比，操作简 单。

3、本发明的方法中，给药间隔为1次/周，符合地贫患者反复输血逐渐引起 的铁过载而诱发的肝肿大和肝纤维化的病理进程；同时可避免短时间大剂量给 铁而引起的小鼠急性铁剂中毒死亡，或给铁间隔过长而使小鼠的造模时间过久。

附图说明

图1是铁过载模型小鼠肝脏横切masson三色染色(×200)；其中，A：对照 组小鼠肝脏切片masson三色染色；B～I：分别为给铁一周至八周的小鼠肝脏切 片masson三色染色；图中黑色箭头指示的是纤维组织。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式 不限于此。

实施例1

地中海贫血Pesaro危险分级所对应的I级铁过载小鼠模型的建立，包括以下 步骤：

取健康C57BL/6小鼠，雄性，8周龄，体重19-23克。于23±2℃、相对湿 度55±5％环境下饲养，设定光照/黑暗为12h/12h昼夜循环。每日给予常规饲料， 自由进食、进水，1周换2-3次垫料。腹腔注射右旋糖酐铁(Fe含量100mg/ml)， 1g铁元素/kg体重，1次/周，共1周。实验重复3次。

利用肝脏指数(肝脏重量与体重的比值)以及肝脏重量增加比率[(每组小 鼠肝脏指数-对照组肝脏指数)/对照组肝脏指数*100]对小鼠的肝脏肿大程度进 行定量分析。表1结果显示，给右旋糖酐铁1周后小鼠肝脏重量增加18.7％。根据 临床经验：人肝肿大2cm，一般对应总体积(重量)增加50％。可判断此时小鼠 未达到Pesaro危险分级中所对应的人肝肿大超过2cm的标准。

Masson三色染色是根据组织的渗透性能不同，选择分子大小不同的两到三 种阴离子染料进行染色，将不同组织区别开来。可将肝脏纤维组织染成亮蓝色 从而判断肝纤维化程度。图1结果显示，给右旋糖酐铁1周后小鼠的肝组织未出 现纤维化。

电感耦合等离子体质谱仪可以准确快速地测出血清中的铁含量。采用该法 对铁过载模型小鼠血清中的铁含量进行检测，表2结果显示，给右旋糖酐铁1周 后小鼠的血清铁含量/空白组血清铁含量为1.1，未出现铁过载现象。由于地贫 Pesaro危险分级中不正规使用去铁胺，一定会导致患者的血清铁过载，故此时“不 正规使用去铁胺”的危险因素不存在。

可见，按照上述方法给右旋糖酐铁1周后，小鼠未出现Pesaro危险分级所对 应的3个危险因素：肝肿大超过2cm、肝脏纤维化和不正规使用去铁胺。可建立 为地中海贫血Pesaro危险分级所对应的I级铁过载小鼠模型。

实施例2

地中海贫血Pesaro危险分级所对应的II级铁过载小鼠模型的建立，包括以 下步骤：

取健康C57BL/6小鼠，雄性，8周龄，体重19-23克。于23±2℃、相对湿度 55±5％环境下饲养，设定光照/黑暗为12h/12h昼夜循环。每日给予常规饲料，自 由进食、进水，1周换2-3次垫料。腹腔注射右旋糖酐铁(Fe含量100mg/ml)，1g 铁元素/kg体重，1次/周，给药2-4周。实验重复3次

表1结果显示，给右旋糖酐铁2-4周后小鼠肝脏重量增加50.7-81.9％，重量增 加大于50％，可判断此时小鼠达到Pesaro危险分级中对应的人肝肿大超过2cm的 标准。

图1结果显示，给右旋糖酐铁2-4周后小鼠的肝组织未出现纤维化。

表2结果显示，给右旋糖酐铁2-4周后小鼠的血清铁含量/空白组血清铁含量 分别为2.5，6.8，28.5。张湘兰认为铁过载患者的血清铁是正常人的10-15倍，其 中血清铁含量/空白组血清铁含量为28.5出现了铁过载现象，符合Pesaro危险分级 中所对应的不正规使用去铁胺导致的血清铁过载。

可见，按照上述方法给右旋糖酐铁2-4周后，小鼠至少出现Pesaro危险分级 的1个危险因素(肝肿大)，但少于3个危险因素(无肝纤维化)。可建立为地中 海贫血Pesaro危险分级所对应的II级铁过载小鼠模型。

实施例3

地中海贫血Pesaro危险分级所对应的III级铁过载小鼠模型的建立，包括以 下步骤：

取健康C57BL/6小鼠，雄性，8周龄，体重19-23克。于23±2℃、相对湿度 55±5％环境下饲养，设定光照/黑暗为12h/12h昼夜循环。每日给予常规饲料，自 由进食、进水，1周换2-3次垫料。腹腔注射右旋糖酐铁(Fe含量100mg/ml)，1g 铁元素/kg体重，1次/周，给药5-8周。实验重复3次

表1结果显示，给右旋糖酐铁5-8周后小鼠肝脏重量增加92.3-135.7％，重量 增加大于50％，可判断此时小鼠达到Pesaro危险分级中所对应的人肝肿大超过 2cm的标准。

图1结果显示，给右旋糖酐铁5-8周后小鼠的肝组织出现纤维化。

表2结果显示，给右旋糖酐铁5-8周后小鼠的血清铁含量/空白组血清铁含量 分别为49.2，56.9，71.4，80.0，出现了铁过载现象，符合Pesaro危险分级中不正 规使用去铁胺导致的血清铁过载。

可见，按照上述方法给右旋糖酐铁5-8周后，小鼠出现了Pesaro危险分级 所对应的3个危险因素，可建立为地中海贫血Pesaro危险分级所对应的III级铁 过载小鼠模型。

表1铁过载小鼠的肝脏指数(％)

表2铁过载模型小鼠的血清铁含量(mg/L)

表3是对实施例1-3的给铁方法所得模型的总结：

表3实施例1-3建立的不同地贫Pesaro危险分级的铁过载小鼠模型

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施 例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替 代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。