半乳甘露聚糖与1，3-β-D葡聚糖在侵袭性烟曲霉菌感染诊断的实验及临床研究

摘要

研究目的：
　　 探讨侵袭性肺部曲霉菌感染大鼠模型制作方法,评价血液、肺泡灌洗液(Broncho-alveolar Lavage Fluid,BALF)和痰液标本半乳甘露聚糖(Galactomannan,GM)和1,3-β-D葡聚糖((1,3)-beta-D-glucan,BG)检测对侵袭性曲霉病(Invasive aspergillosis,IA)的诊断价值。
　　 研究方法
　　 1.建立SD大鼠侵袭性肺曲霉菌感染模型
　　 实验分组:雌性SD大鼠72只,随机分为实验A1、A3、A5组(分别代表接种后第1天(day,d),第3d,第5d处死采样,和正常对照组B组、免疫抑制对照组C组、接种对照组D组,每组各12只。
　　 免疫抑制及感染模型的建立:实验A1、A3、A5组和免疫抑制对照组分别给予每只大鼠肌肉注射地塞米松0.6mg/kg,环磷酰胺75mg/kg,连续3d。免疫抑制第3d,给予实验A1、A3、A5组及接种对照D组双侧鼻孔滴入烟曲霉孢子悬液,每只300～400ul,每天1次,连续2d,对照组B组和C组滴入等量的无菌生理盐水。
　　 血浆、BALF及肺脏标本的采集及处理:实验组接种完成后第1、3、5d分批心脏采血处死大鼠,对照组B、C、D于第5d处死,收集大鼠血清和BALF标本,离心处理后-80℃保存备用。无菌操作下,手术切取大鼠的肺脏,切取部分脏器组织制成匀浆,接种于沙氏平板上培养。其余内脏组织块放入4％多聚甲醛溶液中固定8小时以上,石蜡包埋,进行苏木素-伊红染色,六胺银染色及免疫组化处理。免疫抑制感染各组分别取一份肺脏组织2％磷酸盐戊二醛固定过夜后,行扫描电镜观察。
　　 2.临床标本的收集
　　 依据中华医学会诊断标准,把侵袋性真菌感染(Invasive fungalinfection,IFI)病人分为确诊、临床珍断及拟诊3个级别。依据此临床诊断标准,排除IFI病人作为对照组,收集南方医科大学珠江医院自2008年9月至2009年11月的临床住院病人的血液、BALF和痰液标本。
　　 3 标本的检测
　　 收集大鼠模型的血液及BALF标本,以病理学为标准,按照试剂盒操作要求,用法国伯乐公司生产的Platelia Aspergillus试剂盒和美国ACC公司生产的Glucatell试剂盒检测两种标本的GM和BG含量。同时对收集的临床侵袭性曲霉菌感染病人血液、BALF和痰液标本,用同样方法检测两者GM和BG的水平。
　　 研究结果
　　 1.动物试验中36例实验组老鼠均被病理学证实存在肺烟曲霉菌感染。GM实验检测结果:实验组感染后1d、3d、5d血液GM敏感性分别为58.30％,66.67％,83.33％,平均敏感性为69.44％；实验组感染后1d、3d、5d肺泡灌洗液GM敏感性分别为66.67％,91.67％,100.00％,平均敏感性为86.11％。两种标本GM检测特异性均为100％。各对照组BALF及血液GM检测均为阴性。实验组血浆、BALF的GM实验敏感性、特异性与对照组间差异有统计学意义(P<0.005)。实验组感染后1d、3d、5d BALF检测GM均值呈升高趋势。实验组相同感染天数大鼠BALF GM检测值明显高于血液组(配对t检验,P<0.05)。
　　 G实验检测结果为:实验组感染后1d、3d、5d血液G实验敏感性分别为58.33％,75％,75％,平均敏感性为69.44％；实验组感染后1d、3d、5d BALF标本G实验敏感性分别为75％,83.33％,83.33％,平均敏感性为80.56％。特异性分别为94.44％,100％。实验组感染后1d、3d、5d的平均血液BG浓度均大于20 pg/ml；三个对照组最终血液BG浓度均小于20pg/ml,实验各组血液BG浓度与对照组比较均有显著性差异(单因素方差分析,P<0.001).实验组感染后1d、3d、5d大鼠BALF标本BG浓度均大于20 pg/ml；三个对照组最终血液BG浓度均小于20pg/ml.实验各组BALF的BG浓度与对照组比较均有显著性差异(单因素方差分析,P<0.001)。
　　 2.临床病人检测结果:本研究共收集血液和BALF、痰液病例标本各55例,其中确诊病人标本2例,均为病理确诊曲霉菌病人；临床诊断标本27例；拟诊病人标本16例；正常对照组病例标本10例。GM检测结果:血液GM检测确诊病例、临床诊断病例、拟诊病例GM均值均大于1.5,正常对照病例GM均值小于1.5。病例组GM值与对照组两两比较,除拟诊组无统计学差异外(单因素方差分析,P>0.05),其余各组均有明显统计学差异(单因素方差分析,P<0.05),多重比较分析临床诊断组和拟诊组与确诊组比较间有明显统计学差异(DunnettT3,P<0.05),临床诊断组与拟诊组比较无统计学差异(Dunnett T3,P>0.05)。BALF、痰液GM检测确诊病例、临床诊断病例、拟诊病例GM均值均大于1.5,正常对照病例GM均值小于1.5。病例各组与正常对照组均有明显统计学差异(单因素方差分析,P<0.05),多重比较分析各组两两之间间有明显统计学差异(Dunnett T3,P<0.05)。血液标本组敏感性为77.78％,特异性为70％,阳性预测值为92.11％,阴性预测值为41.18％。BALF、痰液标本组敏感性为84.44％,特异度为80％,阳性预测值95％,阴性预测值为41.18％。
　　 临床病人BG检测结果:血液BG检测确诊病例、临床诊断病例、拟诊病例BG浓度均值均大于20pg/ml,正常对照病例BG浓度均值小于20 pg/ml。病例各组BG浓度与对照病例组两两比较,各组均有明显统计学差异(单因素方差分析,P<0.05),各病例组间BG浓度差异也具有统计学意义(多重比较,P<0.05)。BALF、痰液检测确诊病例、临床诊断病例、拟诊病例BG浓度均值均大于20pg/ml,正常对照病例BG浓度均值小于20 pg/ml。病例各组与对照病例组比较均有明显统计学差异(LSD法,P<0.05),各病例组问BG浓度差异也具有统计学意义(LSD法,P<0.05)。血清标本组敏感性为77.78％,特异性为70％,阳性预测值为92.11％,阴性预测值为41.18％。BALF、痰液标本组敏感性为82.22％,特异性为90％,阳性预测值为97.37％,阴性预测值为52.94％。
　　 结论
　　 1、曲霉菌是深部真菌感染的常见致病菌,其致病性很强。
　　 2、GM和BG检测是诊断深部真菌感染的可靠方法,适用于诊断曲霉菌的深部感染,具有较高的敏感性和特异性。
　　 3、BALF、痰液GM和BG测定方法诊断曲霉菌的深部感染具有较高的敏感性和特异性,且简便、省时、标本收集方便,可用于深部真菌感染的早期诊断。
　　 4、对于缺乏深部真菌感染诊断依据的拟诊患者,血浆、BALF和痰液GM和BG水平的增高可以作为诊断深部真菌感染的依据之一。
　　 5、具有侵袭性曲霉菌感染高危因素的患者,当血浆、BALF和痰液GM或BG水平明显增高,提示有发生侵袭性曲霉菌菌感染的可能。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一部分 侵袭性烟曲霉菌感染动物模型建立及标本检测

材料与方法

结果

讨论

第二部分 侵袭性曲霉菌感染的临床诊断研究

材料与方法

结果

讨论

全文小结

参考文献

综述真菌抗原成分在深部真菌感染诊断方面的应用进展

参考文献

英文缩略词对照

攻读学位期间发表论文

致谢

统计学审稿证明