腺苷酸环化酶激活剂诱导脆性X智力低下一号基因重新表达的机制研究

摘要

脆性X综合征[fragile X syndrome，Fra(X)]是最常见的遗传性智力低下疾病之一。据保守估计，我国至少有20万脆性X病人。目前认为Fra(X)致病机制主要是由于脆性X智力低下一号基因(fragile X mental retardation-1 gene，FMR1)启动子区内(CGG)n三核苷酸重复序列的不稳定扩增及其上游的CPG岛的异常甲基化，使FMR1基因转录及翻译终止，其编码产物—脆性X智力低下蛋白(fragile X mental retardation protein，FMRP)减少或缺如，最终表现为Fra(X)。目前对于Fra(X)的治疗尚无有效的方法，基因治疗仍困难重重，药物重新活化FMR1的方法，也因其存在较强的毒副作用制约了临床应用，寻找有效、安全、低/无毒副作用的药物用于治疗Fra(X)仍是目前研究的热点之一。
　　 已往很多研究提示智力低下与信号转导通路之间有着某种相互联系，其中，环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)信号通路与学习记忆和智力关系最为密切，故Fra(X)与cAMP通路之间的关系也引起了人们的密切关注。人们发现在Fra(X)患者细胞中、在FMR1基因敲除小鼠的脑组织及血小板内，以及在患有Fra(X)的果蝇脑组织内cAMP水平均低于正常，而患有Fra(X)的果蝇可以通过重新植入FMR1基因来弥补这种缺陷，由此提示FMR1基因与cAMP之间可能存在相互调控关系。
　　 Fra(X)患者细胞内cAMP水平降低的原因是什么呢？cAMP的代谢主要与腺苷酸环化酶（adenylate cyclase，AC）和磷酸二酯酶（phosphodiesterase，PDE）的活性有关。前者作用于ATP可生成cAMP，而后者则降解cAMP，以保持胞内cAMP水平的平衡。有临床研究发现一部分Fra(X)患者存在腺苷酸环化酶催化亚单位的功能或者调节的异常。我们前期研究发现FMR1基因封闭后细胞内cAMP水平下降，腺苷酸环化酶活性也明显降低，而磷酸二酯酶的活性则无显著变化。提示FMR1基因的功能缺陷可影响腺苷酸环化酶的活性，推测腺苷酸环化酶活性抑制可能是影响Fra(X)患者细胞内cAMP水平降低的主要原因。
　　 如果FMR1基因转录及翻译终止与腺苷酸环化酶活性降低有关，反之，用药物提高腺苷酸环化酶的活性能否重启被封闭的FMR1基因呢？为了证明我们的猜想，前期在封闭的FMR1基因细胞模型上，我们采用特异性腺苷酸环化酶(AC)激活剂药物弗司可林(forskolin，FSK)改善腺苷酸环化酶的低活性状态，结果发现它的确可有效地重新诱导沉默FMR1基因的转录和蛋白表达，但forskolin对FMR1基因调节的具体机制尚不清楚，是否通过提高cAMP水平这一途径诱导的有待进一步证实。
　　 已知FMRI基因启动子区与FMR1基因的转录密切相关，该区内存在一个具有增强子活性的甲基化敏感区(methylation sensitive element，MSE)，值得注意的是该区增强子内又同时包含一个cAMP反应单位(cAMP-responsive element，CRE)碱基序列，两者结构重叠，关系紧密。而CRE序列是环磷酸腺苷反应单元结合蛋白(CREB)的结合位点。CREB是一种重要的核转录因子，具有调节包括记忆功能在内的广泛的生物学功能，且研究发现CREB可以与FMR1启动子结合并可增强FMR1启动子的活性，因此推测其机制可能是cAMP诱导的。AC激动剂forskolin是否经cAMP通路，通过FMR1启动子区内的MSE/CRE重叠位点实现对FMR1基因调节的尚有待证实。
　　 为了证实以上推测，本研究1.拟直接采用外源性cAMP药物-二丁酰环磷酸腺苷(db-cAMP)诱导沉默FMR1基因的转录和蛋白表达，试图证实forskolin是通过提高细胞内cAMP水平这一途径而达到对FMR1基因再激活作用的;2.以MSE/CRE位点为研究靶点，构建FMR1启动子区MSE/CRE位点双荧光素酶报告基因系统，在不影响MSE整体启动子活性的情况下，分别突变CRE序列，形成突变启动子M1、M2的双荧光素酶报告基因，试图验证forskolin是经FMR1启动子区MSE/CRE位点实现了对FMR1基因的调节，为进一步研究AC激动剂forskolin重启FMR1基因的机制奠定基础，试图为Fra(X)患者的治疗提供新的思路和治疗前景。
　　 研究方法:
　　 1.制作pc12细胞FMR1基因封闭的细胞模型采用硝普钠(sodium nitroprusside，SNP)封闭FMR1基因。硝普钠为经典的一氧化氮(nitric oxide，NO)供体，可通过产生的NO活化DNA甲基转移酶(DNA MeTase)，从而使FMR1启动子区CpG岛的MSE中的胞嘧啶发生高度甲基化，阻断了核酸因子与启动子的结合，抑制了FMR1 mRNA的转录。最后通过real-time PCR观察FMR1基因的封闭效果。
　　 2.观察二丁酰环磷酸腺苷(db-cAMP)对pc12细胞FMR1mRNA的影响1000umol/LSNP作用pc12细胞24h后，实验组分别加入浓度为0.25mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L的db-cAMP，分别于db-cAMP作用6h、12h、24h、48h后收集细胞，提取总RNA。以正常的pc12细胞为正常对照组，以仅加SNP作用的pc12细胞为封闭抑制对照组，用荧光定量PCR(染料法)检测FMR1基因的表达情况。
　　 3.观察二丁酰环磷酸腺苷(db-cAMP)对FMR1蛋白水平(FMRP)的影响
　　 硝普钠封闭pc12细胞FMR124h后，加入0.5mmol/Ldb-cAMP，分别于加药24h、48h、72h、96h后收集细胞（12小时补充失效的db-cAMP，48小时补充失效的SNP），提取蛋白质，进行WesternBlot，对FMRP进行半定量分析。
　　 4.FMR1启动子MSE/CER重叠序列及突变CRE双荧光素酶报告基因的构建
　　 采用PCR的方法从K562细胞DNA中钓取MSE/CRE重叠序列，然后采用PCR点突变的方法分别突变CRE序列，形成突变子M1、M2，分别获得MSE、M1、M2片段，然后连接到PGL3载体上，进而转化到DH5a细胞中，提取质粒。MSE/PGL3、M1/PGL3、M2/PGL3分别与海肾质粒共转染pc12细胞后，对所测荧光素酶活性强度值进行分析。
　　 5.验证CRE位点是腺苷酸环化酶激活剂forskolin重启FMR1基因的关键位点
　　 从DH5a细菌中提取MSE/PGL3、M1/PGL3、M2/PGL3质粒，分别转染pc12细胞后进行分组，加1000umol/LSNP和（或）50umol/Lforskolin，检测荧光素酶活性，比较在正常CRE与突变后CRE状态下，forskolin对FMR1基因开启的影响，通过对荧光素酶值的比较，判断启动子活性（荧光素酶值高，启动子活性则高;反之，则低），以此验证CRE位点是否是腺苷酸环化酶激活剂forskolin重启FMR1基因的关键位点。
　　 6.统计
　　 实验所得数据经SPSS13.0统计软件进行统计学处理，数据用均数士标准差((X)±s)表示。荧光定量PCR结果采用2-△△CT值分析，采用单因素方差分析;因方差不齐，组间两两比较采用DunnettT3;与正常组的比较采用单样本t检验。WesternBlot数据采用Bia-RadGel-ProAnalyzer软件分析所得A值之比，因方差齐性，组间两两比较采用LSD;相对荧光素酶活性检测数据应用相对荧光素酶活性强度值分析，采用析因设计资料方差分析，因方差齐性，组间两两比较采用LSD。p＜0.05表示有统计学差异。
　　 研究结果
　　 1.不同浓度及不同时间点db-cAMP对封闭的FMR1转录水平的影响
　　 db-cAMP在0.5mmol/L作用12h时FMR1mRNA激活效果最强，FMR1mRNA的表达量约为封闭组的9.7倍(P＜0.05)，约为正常组的0.86倍(P=0.135)。0.5mmol/Ldb-cAMP的激活效果维持时间小于18小时。
　　 2.db-cAMP对FMRP表达的影响
　　 用SNP1000μmol/L封闭FMR1基因，作用72h时FMRP表达量最低，约为正常组的0.56倍;在SNP封闭的基础上，加入0.5mmol/Ldb-cAMP可提高FMRP表达量，作用72h时激活效果最好，为正常组的0.98倍(P＜0.05)，是封闭组的1.25倍(P＜0.05)。
　　 3.荧光素酶载体构建
　　 PCR、双酶切验证后送测序，测序结果均符合设计。pGL-3/MSE位、pGL-3/M1位、pGL-3/M2位质粒、pGL3basic与海肾质粒共转染pc12细胞，质粒均成功转入pc12细胞，并且具有启动子活性，显示脆性X智力低下一号基因启动子双荧光素酶报告基因载体构建成功。
　　 4、腺苷酸环化酶激活剂forskolin重启FMR1基因CRE位点验证
　　 (1)经SNP封闭作用后，MSE位、M1位、M2位三组与未加SNP的各自正常对照组比较均有统计学意义(P＜0.05)，提示经SNP作用，三组FMR1均被SNP封闭成功。
　　 (2)未经SNP封闭，单经forskolin处理后，MSE位、M1位、M2位三组分别与各自的对照组相比较均无统计学意义(P＞0.05)，提示forskolin对正常活性的FMR1启动子，无论CRE序列结构正常或突变，均无增强作用。
　　 (3)已被SNP封闭后的FMR1，再添加forskolin处理，当CRE位点正常时，MSE组的荧光素酶活性显著高于未添加forskolin的封闭对照组(P＜0.05);在突变了CRE结合位点的M1组和M2组中，添加forskolin组与未添加forskolin封闭对照组均无显著性差异(P＞0.05)。由此提示，当FMR1启动子活性低下时，在CRE结构正常情况下，forskolin可开启封闭的FMR1基因，而当突变CRE序列后，forskolin对FMR1封闭基因的开启作用则消失。
　　 以上结果显示当CRE位点正常时，forskolin对活性低下的FMR1启动子有显著地激活作用，而对正常活性的FMR1启动子则无增强作用;当CRE位点突变之后，forskolin对正常活性、低下活性的FMR1启动子均无开启作用。
　　 结论
　　 1.发现直接采用外源性环磷酸腺苷(db-cAMP)也可有效地重新诱导被封闭的FMR1基因和蛋白表达，这有望为Fra(X)发病机制的研究和临床治疗提供新的思路和治疗前景。
　　 2.证实了cAMP激活剂forskolin开启FMR1封闭基因的机制之一是通过提高细胞内cAMP水平而实现的。
　　 3.成功构建FMR1启动子区MSE/CRE位点双荧光素酶报告基因系统，结果显示当CRE位点正常时，forskolin对活性低下的FMR1启动子有显著地激活作用，而当CRE位点突变之后，forskolin则无此作用，由此证实CRE位点是forskolin重启FMR1基因的关键位点。推测AC激动剂forskolin可能主要是通过FMR1启动子区内的MSE/CRE重叠位点，经cAMP通路实现了对FMR1基因的调控。

目录

摘要

前言

第一章 二丁酰环磷酸腺苷诱导脆性X智力低下一号基因重启及再表达的研究

引言

一、材料和仪器

二、方法

结果

讨论

附图及数据表

第二章 腺苷酸环化酶激活剂forskolin重启FMR1基因CRE位点的验证

引言

一、材料与仪器

二、方法

结果

讨论

附图及数据表

全文总结

参考文献

综述

中英文对照缩略词

研究生期间发表和撰写的文章

致谢

声明

统计学审稿证明