LIN28B在结肠癌中的表达及其与预后相关性研究

摘要

背景与目的：
　　 近年来，随着人民生活水平的不断提高，饮食习惯和饮食结构的改变以及人口老龄化，我国结直肠癌的发病率和死亡率均保持上升趋势。其中，结肠癌的发病率上升尤为显著。结肠癌的发生发展涉及多基因多阶段，深入研究其关键分子机制为新药开发和临床治疗具有极大的社会价值和现实意义。
　　 LIN28B是近年新发现的一个与肿瘤发生发展相关的新基因，其异常表达可促进肿瘤发生发展，它编码一种具有冷休克结构域和反转录病毒型锌指结构的胞浆蛋白，在秀丽隐杆线虫中最先发现，参与维持干细胞“干性”，位于6q21，长度为752个碱基，GeneBank编号为NM001004317。LIN28B蛋白在胚胎干细胞和发育组织中高表达，随细胞分化而逐渐低表达，在肿瘤组织中则反常高表达。LIN28B实质为一种高度保守的RNA结合蛋白，大小为27kDa，在肝细胞癌中首先得到克隆，能够在肝细胞癌中高表达并和细胞过度增殖相关。目前，LIN28B被认为是“癌胚基因”，可促进细胞恶性转化并特异高表达于部分进展期肿瘤，如肝细胞癌和结肠癌。国内外研究认为LIN28B主要通过抑制非编码的let-7microRNA家族来实现其促癌作用。
　　 miRNA是近年来的研究热点，是非编码RNA中的一员，不编码蛋白，但能在转录后降解或抑制靶mRNA翻译而实现基因沉默作用。和蛋白编码基因一样，miRNA基因的最终表达也受到基因组DNA拷贝数、转录因子和表观遗传机制调控、转录后生物加工过程这三个层次的调控。LIN28B通过抑制let-7miRNA家族转录后加工成熟来实现其促癌作用。let-7家族于1993年首次在人基因组中被发现，多种肿瘤组织包括结肠癌中该家族均低表达。let-7家族通过靶向K-RAS、HMGA2、c-Myc、LIN28B及Bcl-xL等癌基因以及E2F2、CCND1/2等细胞周期相关蛋白来实现肿瘤抑制作用。相反，miR-21高表达于多种肿瘤包括结直肠癌，其靶基因包括PTEN、PDCD4等抑癌基因。目前，let-7和miR-21被认为分别是经典的抑癌和促癌miRNA。不仅如此，它们还被证明与肿瘤细胞化疗耐药相关。有趣的是，最新的研究证明let-7家族和miR-21共同参与了炎症促进结肠腺癌发生的正反馈信号环路。在该环路中，LIN28B在pri-let-7转录后多层次抑制其表达，同时let-7也可靶向沉默LIN28B，形成负反馈。LIN28B可由转录因子c-Myc激活，据前述c-Myc也是let-7的靶基因，但c-Myc高表达又能通过激活LIN28而下调let-7。因此，LIN28B和let-7之间形成复杂的相互对抗关系。在这个信号环路中，miR-21位于LIN28B和let-7的下游，但其也通过PTEN间接激活了NF-κB而参与了该正反馈的维持。
　　 另一方面，大量研究认为肿瘤干细胞具有成体干细胞的特点。LIN28/let-7环路调控ALDH1阳性肿瘤干细胞的“干性”，LIN28和OCT4则与卵巢癌干细胞相关。反之，Raf激酶抑制蛋白(Raf kinase inhibitory protein，RKIP)能通过LIN28/let-7环路而抑制胃癌转移发生。综上，LIN28B非常可能参与结肠癌的发生发展。
　　 转移和复发是导致结肠癌患者死亡的两个最主要的死亡原因，最新研究结果表明，在结肠癌中LIN28B高表达与结肠癌的转移复发相关。化疗是目前结肠癌综合治疗中的重要一环。奥沙利铂是结肠癌化疗的一线用药，但结肠癌细胞对奥沙利铂的耐药性严重影响化疗效果，研究其内在机制有助于提高化疗效果并降低结肠癌术后复发及转移。
　　 RNA干扰是近年来兴起的新技术，它可以通过短发夹RNA(small hairpin RNA，shRNA)与体内靶mRNA结合，从而产生序列特异性基因沉默，该方法目前成为研究基因功能及筛选分子靶向药物的良好工具。截至目前国内尚无LIN28B在结肠癌组织中的表达情况及其与病人淋巴结转移、远处转移等病理特点及生存复发情况关系的报道。此外，国内外关于结肠癌细胞中LIN28B基因表达及其与奥沙利铂化疗敏感性的研究尚属空白。本研究第一部分利用EnVision免疫组织化学技术检测美国Biomax结肠癌组织芯片(208例结肠癌，8例正常组织)和南方医科大学南方医院149例手术切除石蜡切片中LIN28B的表达并进行染色评分，采用卡方检验比较不同LIN28B表达水平和结肠癌临床病理性特征之间的关系，采用Kaplan-Meier法及Log-rank检验进行生存分析，采用Cox比例风险模型进行结肠癌生存和复发的单因素和多因素分析，判断LIN28B在结肠癌预后中的临床价值。
　　 第二部分我们构建干扰LIN28B的shRNA质粒(sh-LIN28B)，将其转染至结肠癌细胞(SW480、HCT116和Caco2细胞)，并设立对照组;采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Westernblot分别检测结肠癌细胞中LIN28B在mRNA和蛋白水平的表达;采用CCK-8法检测sh-LIN28B和奥沙利铂化疗协同作用，Transwell方法检测处理后的结肠癌细胞迁移能力，了解抑制LIN28B对结肠癌细胞奥沙利铂化疗敏感性的影响，并对可能涉及的机制进行探讨。
　　 方法：
　　 1.选择美国Biomax的结肠癌及正常组织组合微阵列芯片，包含208例肿瘤和8例正常结肠组织的病理信息。208例结肠癌中男118例，女90例，年龄24～82岁，平均年龄54.8岁，高分化腺癌83例，中分化腺癌8例，低分化腺癌4例。Ⅰ期2例，Ⅱ期130例，Ⅲ期46例，Ⅳ期11例。发生淋巴结转移55例，无淋巴结转移153例，伴远处转移11例，无远处转移197例。
　　 2.选择2003年1月至2004年12月南方医科大学南方医院149例行手术切除的结肠癌石蜡标本。其中，男性患者88例，女性61例，年龄19～85岁，平均年龄56.9岁;高分化腺癌70例，中分化腺癌67例，低分化腺癌12例，原位癌1例;TNMI期25例，Ⅱ期65例，Ⅲ期42例，Ⅳ期16例;发生淋巴结转移52例，无淋巴结转移97例，远处转移16例，无远处转移133例。
　　 3.所有标本均详细记载病人基本信息，记录肿瘤TNM分期、分化程度、淋巴结转移和远处转移情况。两组研究对象均将高、中分化腺癌归入分化较好组，将低分化腺癌归入分化较差组。
　　 4.采用EnVision免疫组化法检测组织芯片和石蜡切片中LIN28B蛋白表达，由两名病理科医师在双盲情况下对每个标本进行染色评分。结果按照如下标准进行判断:阴性为无色，阳性为细胞质染色呈棕黄色。根据阳性染色细胞百分比计分:高倍镜下每张切片选择10个有代表性的视野，每个视野计数100个肿瘤细胞共计数1000个细胞。0分为阳性细胞数小于或等于5％，1分为阳性细胞数10％～25％，2分为阳性细胞数25％～50％，3分为阳性细胞数大于50％，将0～2分计为低表达，3分为高表达。
　　 5.采用卡方检验比较不同LIN28B表达水平和结肠癌病理性特点包括组织分级、TNM分期、淋巴转移及远处转移之间的关系。
　　 6.采用Kaplan-Meier法及LogRank检验进行生存分析。采用Cox比例风险模型，以(Forward:LR)法筛选变量，进行结肠癌生存和复发的单因素和多因素分析。
　　 7.细胞培养:人结肠癌细胞SW480、HCT116和Caco2，在含10％胎牛血清的DMEM培养液、37℃、5％CO2、饱和湿度的条件下连续培养。
　　 8.细胞转染及奥沙利铂处理:成功构建干扰LIN28B的shRNA质粒(sh-LIN28B)，将其转染至结肠癌细胞(SW480、HCT116和Caco2细胞)，并设立对照组;sh-LIN28B和NC质粒采用脂质体Lipofectamine2000进行转染。细胞分组:(1)空白对照组(Con-A):未经任何处理的人结肠癌细胞;(2)空载对照组(Con-B):即脂质体对照组;(3)空载对照和奥沙利铂组(NC+oxaliplatin);(4)sh-LIN28B和奥沙利铂组(sh-LIN28B+oxaliplatin)。奥沙利铂处理细胞4小时后换10％胎牛血清的RPMI1640。
　　 9.RT-PCR:取上述分组细胞采用定量RT-PCR方法进行mRNA水平检测。用Trizol试剂盒提取细胞总RNA，采用逆转录试剂盒合成cDNA;以cDNA为模板进行PCR扩增。
　　 10.Westernblot:取上述分组细胞进行蛋白水平检测。
　　 11.细胞迁移实验:在Transwell的上室中加入每孔150μl的细胞，加入含不同浓度奥沙利铂的培养液，每组设3个复孔，对照组为空白对照组。在对应Transwell下室中加入DMEM培养基，培养12h后取出Transwell小室，擦净小室底部微孔滤膜上层的细胞，于显微镜下观察滤膜下层的细胞。计算方法为40倍光学显微镜下随机计数3个视野的细胞，取平均值。
　　 12.CCK-8细胞增殖检测:取上述分组细胞分别接种于96孔板，用不同浓度的奥沙利铂孵育4h后更换为新鲜完全培养基继续培养20h，在不同时间点，加入10μlCCK-8溶液孵育2小时，在酶标仪上读取各组吸光度值。
　　 结果：
　　 1.美国Biomax结肠癌组织芯片免疫组化结果显示，LIN28B表达0分57例(27.4％)，1分71例(34.1％)，2分56例(26.9％)，3分24例(11.5％)。其在结肠癌组织中表达高于正常结肠组织;在中国南方医院结肠癌石蜡标本中LIN28B表达0分39例(26.2％)，1分56例(37.6％)，2分13例(8.7％)，3分41例(27.5％)。
　　 2.采用x2检验比较结肠癌组织芯片中LIN28B不同表达水平与临床病理特征的关系，结果显示LIN28B的高表达均与肿瘤较差分化、较高TNM分期(P＜0.001)、淋巴结转移(P＜0.001)及远处转移有关(均P＜0.001);而LIN28B较低的表达与中-高分化、TNMI-Ⅱ期相关。在结肠癌石蜡标本中LIN28B的高表达亦与肿瘤较差分化(P=0.031)、较高TNM分期(P＜0.001)、淋巴结转移(P=0.001)及远处转移有关(均P＜0.001)。
　　 3.单因素和多因素预后分析结果显示LIN28B表达情况(P＜0.001)是影响结肠癌患者生存的独立预后因素(OR=39.840)，LIN28B表达情况是影响结肠癌患者复发的独立危险因素(OR=40.077)。
　　 4.在体外实验中，RT-PCR和Westernblot结果证实SW480、HCT116和Caco2结肠癌细胞中均有LIN28B基因表达，其中HCT116细胞表达最弱，SW480细胞最强。因此我们以后的实验均选择这两种细胞进行。
　　 5.RT-PCR和Westernblot结果显示，特异性的干扰shRNA表达质粒(sh-LIN28B)(转染后48h)在50nM和100nM的浓度下可显著下调SW480和HCT116结肠癌细胞LIN28B的mRNA和蛋白表达。其中，SW480细胞中LIN28B的mRNA在两组中分别下调约36％和70％;在HCT116细胞中两组均为约90％。
　　 6.CCK-8结果显示经过奥沙利铂处理48小时后，HCT116细胞的IC50值为6.09±1.42μg/ml，SW480细胞升高34.3％至8.18±3.64μg/ml。提示SW480细胞较高的基础LIN28B表达水平可能影响奥沙利铂化疗毒性。联合转染NC或sh-LIN28B和奥沙利铂分别处理HCT116、SW480细胞，CCK-8结果显示，相比于NC联合转染组，sh-LIN28B联合奥沙利铂处理组在转染后96小时可显著降低SW480和HCT116细胞生存分别达52.9％和50.0％，提示沉默LIN28B表达可促进SW480和HCT116结肠癌细胞奥沙利铂化疗敏感性。
　　 7.Transwell结果显示相比于NC转染组，sh-LIN28B显著抑制SW480细胞的迁移(3个随机视野，平均为49.4％)。
　　 结论：
　　 LIN28B表达与结肠癌病理特征密切相关，并在结肠癌进展中起重要作用，可作为预测结肠癌患者术后生存复发的指标。沉默表达于结肠癌细胞的LIN28B，可显著抑制结肠癌细胞的迁移能力并促进奥沙利铂的化疗敏感性。LIN28B基因沉默有望成为结肠癌辅助化疗中新的分子靶向药物靶点。
　　 本研究的创新之处
　　 1.我们用免疫组化法检测组织芯片和石蜡切片中LIN28B蛋白表达并评分。采用卡方检验比较不同LIN28B表达水平和结肠癌病理性特点之间的关系。发现LIN28B在结肠癌组织中相比于正常结肠组织高表达，其高表达与肿瘤的低分化、TNMⅢ-Ⅳ期、结肠癌局部淋巴结转移及远处转移有关。
　　 2.采用Kaplan-Meier法及Log-rank检验对结肠癌患者进行生存分析。采用Cox比例风险模型，以(Forward:LR)法筛选变量，进行结肠癌生存和复发的单因素和多因素分析。结果显示LIN28B表达情况是影响结肠癌患者生存和复发的独立危险因素。
　　 3.利用shRNA抑制结肠癌细胞LIN28B表达，发现靶向沉默LIN28B表达可促进SW480和HCT116结肠癌细胞奥沙利铂化疗敏感性。

目录

封面

摘要

英文摘要

前言

第一部分 LIN28B在结肠癌中的表达及其与预后的关系

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

参考文献

第二部分 沉默LIN28B基因表达对人结肠癌细胞奥沙利铂化疗敏感性的影响

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

参考文献

全文小结

中英文缩略词表

成果

致谢

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统计学审稿证明