转基因食品DNA提取及寡核苷酸芯片检测技术的研究

摘要

转基因生物(Genetically Modified Organism，GMO)是利用现代分子生物技术，将某些生物的基因转移到其他物种中，改造生物的遗传物质，使其在形状、营养品质、消费品质等方面向人们所需要的目标转变。以转基因生物为直接食品或为原料加工生产的食品就是“转基因食品(Genetically Modified Foods，GMF)”。
　　 随着基因工程技术的日趋成熟及在农产品上的广泛应用，转基因食品应运而生，并以惊人的速度进入人们的生活。2011年全球转基因作物种植面积达1.6亿公顷，比1996年的170万公顷增长94倍，而以转基因作物为原材料加工的食品已达上万种。转基因食品给人类带来了丰富的食品供应和巨大的经济效益，但到目前为止，转基因食品对人类健康的安全性一直受人们质疑。某些转基因食品引起中毒、过敏反应、降低人体抵御病毒的能力、改变机体肠道菌群平衡等危害已有报道。为了维护消费者的知情权和选择权，世界上的很多国家和地区先后出台了相应的法律和管理方法，对转基因食品实行强制标识或自愿标识。2002年我国农业部颁布的《农业转基因生物标识管理办法》，规定对5大类17种产品必须进行标识。
　　 对转基因食品进行标识基于能检测到转基因成分。因此建立准确、快速、高效的转基因成分检测技术至关重要，而高质量DNA模板的获取，是转基因食品进行基因检测的前提和关键。
　　 核酸提取包含样品的裂解和纯化两大步骤。裂解是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程，纯化则是使核酸与裂解体系中的其它成分，如蛋白质、多糖、盐等杂质彻底分离去除的过程。裂解方法包括化学裂解法（表面活性剂SDS、CTAB、高盐等）、酶裂解法（蛋白酶K、溶菌酶、裂解酶等）和机械裂解法（研磨等）。最常用的纯化方法，一是有机溶剂抽提再沉淀，二是介质纯化。介质纯化是利用某些固相介质，在特定的条件下选择性吸附的特点，实现核酸与蛋白质及其他杂质的分离。
　　 由于加工食品成分复杂，DNA破坏降解严重，因此从加工食品中提取DNA，潜在困难很大。目前国内外很多学者在积极探索、深入研究各种高效的转基因食品DNA提取方法。本研究针对转基因食品的不同加工程度，构建和优化了各种加工程度的食品DNA的提取方法。
　　 首先，对于转基因农产品，采用Chelex-100法快速提取转基因农产品DNA，Chelex-100是一种由苯乙烯和苯二乙烯共聚体组成的化学离子螯合树脂，其悬液在碱性环境(pH10～11)和100℃的条件下，可导致细胞破裂，DNA从细胞核中释放，同时Chelex-100能结合许多可能影响下一步分析的非核酸物质。由于Chelex-100能有效除去非核酸有机物，并且通过结合金属离子，防止DNA降解，具有经济、简便、高效等优点，目前已被广泛用于从微量血液、组织斑块、精斑、骨骼等法医物证检材。本研究比较国标（GB/T19495.3-2004）CTAB-1法和Chelex-100法提取转基因大豆GTS40-3-2 DNA浓度和纯度，对检测结果进行统计学分析，结果显示Chelex-100法提取的DNA浓度较国标CTAB-1法高(t浓度=10.424，P浓度=0.000)，而纯度较CTAB-1法低（t纯度=12.684，P纯度=0.000），但是作为模板用于PCR扩增，效果与CTAB-1提取方法并无明显差别;对比两种方法提取的DNA在-20℃下保存一个月内的PCR检测效果，结果未见明显差别;将Chelex-100法应用于其他农产品的DNA提取，效果理想。
　　 其次，对于轻中度加工食品，采用改良传统的CTAB法。CTAB法是提取植物DNA的经典方法，也是文献报道最多的提取转基因食品DNA的方法，但是传统的CTAB法由于操作繁琐，耗时长，试剂组成复杂，酚、氯仿等有机溶剂易造成环境污染等问题，在使用上受到一定的限制。本研究改良传统CTAB法，利用硅膜吸附柱纯化DNA，减少应用氯仿等有毒的有机溶剂，大大缩短了操作时间，比较该方法与国标(GB/T19495.3-2004) CTAB-1法提取转基因大豆GTS40-3-2 DNA的浓度和纯度，对检测结果进行统计学分析，结果显示改良CTAB法提取的DNA浓度和纯度均较国标CTAB-1法高(t浓度=9.471，P浓度=0.001;t纯度=3.253，P纯度=0.031)，差异具有显著性意义，表明该方法提取的DNA效果较理想，同时将其应用于轻中度加工食品的DNA提取中，取得理想效果。
　　 第三，针对油脂经过深加工，DNA含量低，且受破坏严重，提取难度大的特点，本研究利用硅膜吸附柱为介质，结合DNA担体鲑鱼精子DNA，建立了一种稳定有效的从食用油中提取DNA的方法，将其应用于5个品牌11种食用油的DNA提取，核酸进行定性PCR、LAMP、荧光定量PCR检测，效果理想。
　　 最后，高质量DNA模板的提取是转基因食品检测的前提与关键，而转基因成分的检测是最终目标。目前转基因食品检测包括基于外源蛋白质靶标的蛋白质检测方法和基于核酸水平的检测方法。由于蛋白质检测成本高，所需时间长，加上蛋白质对热敏感，加热过程中容易变性，经过加工的转基因食品，绝大部分蛋白质变性，检出率较低，现在该类检测实际工作中较少涉及。核酸水平的检测包括PCR技术、基因芯片技术检测等。单纯的PCR检测技术有容易污染、易出现假阳性等缺点。基因芯片技术是近年来在生命科学领域兴起的一项生物高新技术，具有快速、敏感、准确、高通量等特点，可对大样本的样品进行筛查及鉴定。靶基因的标记是基因芯片实验流程的一个重要环节，多重PCR扩增标记是在多重PCR扩增过程中加入荧光标记，在扩增的同时进行荧光标记，特异性高。多重PCR与基因芯片整合可以实现两种技术的优势互补，通过PCR的扩增标记作用和芯片的荧光探针杂交技术可使此种检测体系达到较高的灵敏度和特异度。本研究针对转基因食品5大物种13个品系的筛选基因、目的基因、内源基因、转化体特异性基因设计特异性引物和探针，建立了5大物种13个品系的转基因食品基于多重PCR的寡核苷酸基因芯片方法检测方法，对各个品系转基因食品标准品进行检测，达到较理想检测效果。
　　 本课题通过实验室研究，得到以下实验结果:
　　 1、探究了一种经济、简便、快速的DNA提取方法——Chelex-100法，适合于转基因农产品的大规模筛选和鉴别;
　　 2、改良传统CTAB法，利用硅膜吸附柱纯化DNA，减少应用有毒的有机溶剂，大大缩短了操作时间，将其应用于轻中度加工食品的DNA提取中，取得理想效果;
　　 3、构建了一种效果佳、通用性好、性价比高的油脂DNA提取方法，稳定有效地从食用油中提取DNA;
　　 4、在芯片的探针设计、样品扩增标记和杂交过程中，引入多种探针及样品作为内、外质量控制，有效的防止了检测应用中假阳性、假阴性结果的产生;
　　 5、采用多重PCR法进行基因组扩增标记，完成了芯片的实验室测试，实验结果表明多重PCR扩增标记技术是一项良好的DNA标记技术;
　　 6、针对5大物种13个品系转基因作物设计了26条寡核苷酸探针，制备转基因食品检测基因芯片，对各个品系标准品进行检测，结果与标准品符合率达100％，表明该芯片能初步应用于转基因样品的筛查与检测。
　　 综上所述，转基因食品DNA的提取和纯化是转基因食品检测的基础与前提，建立一套系统、完善的转基因食品的DNA提取方法至关重要。根据不同加工程度的转基因食品建立的转基因食品DNA提取方法具有针对性好、效率高、效果稳定等优点，所提取的DNA能满足定性PCR、实时荧光定量PCR、LAMP和基因芯片检测等分子生物学的实验需求。基于多重PCR的转基因食品寡核苷酸基因芯片检测方法，综合利用了多重PCR的高效率扩增标记和基因芯片具有大规模、高通量、高度敏感与高度特异性等特点，可以更有效地提高特异性和灵敏度。小规模的转基因作物标准品检测实验结果表明，本研究建立的基因芯片特异性好、效果稳定。利用该方法可以对不同的转基因食品进行同步、快速、准确地检测，为大批量的转基因食品的筛查、检测、监管提供了快速、灵敏、准确的检测手段。

目录

摘要

前言

第一章 Chelex-100法快速提取转基因农产品DNA

1．1 材料与方法

1．2 结果

1．3 讨论

第二章 改良CTAB法提取转基因食品DNA

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

第三章 食用油DNA高效快速的提取方法

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

第四章 转基因食品寡核苷酸芯片检测技术的研究

4．1 材料与方法

4．2 结果

4．3 讨论

结论

中英文缩略词表

攻读学位期间成果

致谢

参考文献

声明

统计学审稿证明