TPO+HGF+Il-3方案对人骨髓源性肝干细胞各亚群体外扩增的促进作用

摘要

在从事骨髓干细胞的相关研究中，某些实验研究证明了骨髓中部分干细胞具有向肝系细胞分化的潜能，于是就提出了“骨髓源性肝干细胞(bonemarrow-derived liver stem cell)”这一概念。骨髓源性肝干细胞(BMDLSC)是肝干细胞的肝外重要来源，能够在特定条件下分化成为肝细胞样细胞甚至是肝细胞，进而在肝脏的修复与重建中扮演重要的角色。就目前而言，自体骨髓干细胞移植治疗肝硬化作为治疗肝硬化的一种新方法，是世界上最前沿、最热门的医疗技术之一。其原理是将患者健康的骨髓分离出干细胞，并将分离纯化干细胞经肝动脉或门静脉再回输至病肝内，并让这些干细胞在肝内“落户”发挥功能。在临床工作中，肝移植面临着肝源短缺、费用昂贵等问题，而骨髓源性肝干细胞的自体移植，则具有取材方便，易于体外扩增，而且不存在组织配型及免疫排斥等优势。但是，人体骨髓中的间充质干细胞含量极少，大约每104～105个单个核细胞中含有1个间充质干细胞(MSC)[1]，而临床应用骨髓干细胞移植治疗疾病则需要具备一定的数量以及较高的纯度，因此，人骨髓源性肝干细胞的体外纯化培养扩增、鉴定和各个干细胞亚群扩增情况的了解分析就显得尤为重要。
　　 在体外诱导MSC分化成为肝样细胞甚至肝细胞，一些维持细胞功能、诱导细胞分化的刺激因素是必不可少的，例如生长激素、细胞因子、细胞外基质或者与其他类型的细胞共同培养。目前，关于骨髓源性肝干细胞的诱导分化培养模式国内外尚未形成统一的标准。各种培养模式所用的细胞因子不同，有单一使用某种细胞因子，也有联合多种细胞因子的。本研究小组探讨了
　　 TPO+HGF+IL-3组合培养方案，建立了一种稳定的分离纯化并能有效扩增干细胞的途径，为获得大量纯化的骨髓源性肝干细胞并进而研究其作为种子细胞治疗疾病提供了相关实验基础。肝细胞生长因子（Hepatocyte Growth Factor，HGF）为肝再生的特异性因子，与其受体c-met相结合而起作用，特别是在细胞密度较低的情况下，肝细胞生长因子对肝干细胞的迁移、增殖起基础作用，能有效的诱导肝干细胞分化为肝细胞，并且此作用效果与HGF的浓度有关系。白细胞介素-3(Interleukin-3，IL-3)和血小板生成素(Thrombopoietin，TPO)等亦在骨髓源性肝干细胞的增殖分化诱导中起着重要的调节性作用。
　　 迄今为止，科研人员尚未发现可直接鉴定骨髓源性肝干细胞的特征性表面标志，其在骨髓干细胞衍生过程中的具体谱系定位也不太清楚，但是相关研究表明表达CD90、CD105、CD117、CD184、CD326细胞表型的是具有肝干细胞潜能的细胞亚群[2、3]。
　　 本实验应用非连续性梯度密度离心法（Percoll分离液）从人骨髓中分离出富含目标细胞的细胞组分。采用TPO+HGF+IL-3的联合培养方案，骨髓源性肝干细胞的体外扩增调整初始扩增的细胞密度为2.50×106/ml。实验组为添加有血小板生成素(TPO)50ng/ml、促肝细胞生长素(HGF)40μg/ml、白细胞介素-3(IL-3)10ng/ml的高糖DMEM培养基体系，对照组则不含TPO+HGF+IL-3，倒置相差显微镜下观察诱导分化细胞胞体大小、形态、核仁数目及核浆比例的变化，分别在第1、7、14天，计算培养细胞总数，并采用流式细胞技术分别测算表达CD90、CD105、CD117、CD184、CD326的人骨髓源性肝干细胞各亚群的比例变化及增长倍数等。建立了一种能稳定分离、纯化、培养并有效扩增骨髓多能前体干细胞的方法，为获得足量的纯化的骨髓源性肝干细胞并进而研究其作为种子细胞治疗多种临床疾病提供了实验基础。实验结果显示表达CD90、CD105、CD117、CD184、CD326的人骨髓源性肝干细胞各亚群的数量变化在第7天分别为4.94、4.89、6.70、5.72、5.03倍，及第14天数量增长倍数为7.60、7.76、11.70、21.38、8.12倍。从数据分析中可见实验组中的各个亚群均有稳步的增长，其中以表达CD184的亚群增加最为迅速。本实验证实了TPO+HGF+IL-3方案能够稳定培养和扩增骨髓源性肝干细胞，此组合培养方案对人骨髓源性肝干细胞各亚型的体外扩增有明显的促进效果，其中以表达CD184亚群的扩增效果最为明显。
　　 本课题的特点及意义:采用了TPO+HGF+IL-3细胞体外培养方案，促进骨髓源性肝干细胞的扩增，选择了五个人骨髓源性肝干细胞的亚群，了解不同的亚群在此方案的作用下数量有何变化及关系，探讨了此方案下不同的亚群总体数量及比例的变化，增长最明显的亚群，在临床应用方面，为进一步的人体应用骨髓源性肝干细胞的治疗相关疾病的提供了实验依据。
　　 材料和方法:
　　 1.骨髓源性肝干细胞的分离纯化培养
　　 1.1骨髓来源
　　 所取骨髓量约10ml至15ml，这些骨髓取自2011年05月至2011年10月之间南方医科大学附属南方医院骨科手术患者（无血液系统疾病），标本为随机选取骨科手术，取髂骨内所含骨髓七份;健康成人髂前上棘骨髓一份;最终纳入实验的总共有八份。
　　 1.2主要试剂
　　 percoll分离液（pharmacia），高糖DMEM(GIBCO)，PBS缓冲液(newprobe)，促肝细胞生长素（HGF，吉林华康），促血小板生长素(TPO，peprotech)，白细胞介素3(IL-3，peprotech)，荧光标记抗人抗体CD90-FITC、CD105-APC、CD117-PE、CD184-APC、CD326-PE(eBioscience)、胎牛血清(FCS，Hyclone)、0.25％胰酶(Hyclone)、青霉素和链霉素。
　　 1.3实验方法
　　 1.3.1目标细胞的分离
　　 使用percoll作为分离液，分成60％(1.077 g/ml)、50％(1.067 g/ml)、40％(1.056 g/ml)、30％(1.043 g/ml)四个密度梯度，取新鲜抗凝人骨髓10-15ml，经percoll液不连续密度梯度离心分离，选取密度为40％-50％之间的细胞组分。
　　 1.3.2目标细胞的培养
　　 调整细胞起始的培养密度为2.50×106个/ml，培养环境为1ml，培养面积为2cm2。实验组为:加入血小板生成素(TPO)50ng/ml、促肝细胞生长素(HGF)40μg/ml、白细胞介素-3(IL-3)10ng/ml含10％血清的高糖DMEM培养基体系;对照组则为含10％血清的高糖DMEM培养基体系。细胞于37℃、5％CO2孵育箱中培养，每3～4 d更换一次培养基。
　　 1.3.3细胞计数及形态学变化
　　 分别于培养的第1、7、14天，将细胞计数板，盖玻片用10％的酒精擦干净。将盖玻片盖子计数板上。常规准备细胞悬液，吹匀，抽取少量，由盖玻片边缘加入。计算四大格的细胞数。按如下公式:细胞数/ml=四大格/4×104×稀释倍数。
　　 倒置相差显微镜下观察诱导分化培养细胞胞体大小、形态、核仁数目及核浆比例的变化。
　　 2.人骨髓源性肝干细胞各细胞亚型的扩增情况
　　 2.1流式细胞仪检测各亚群的数量变化
　　 采用上述培养方案后，分别于培养的第1、7、14天，用胰酶消化贴壁细胞后，计数，在100μl环境中按5×105个细胞分别加入5μl抗人CD90-FITC、5μl抗人CD105-APC、20μl抗人CD117-PE、20μl抗人CD184-APC、20μl抗人CD326-PE，于冰上避光孵育30 min，600 g离心3 min，去除上清，后用PBS吹打均匀细胞，再次600g离心3min，清洗2次，1％多聚甲醛固定;迅速行流式细胞仪(BD公司FACS Caliber)检测CD90、CD105、CD117、CD184、CD326细胞所占的百分率。
　　 2.2数据处理
　　 采用SPSS13.0统计软件处理数据，行独立样本t检验，非参数秩和检验;结果以均值±标准差表示;P＜0.05差别有显著意义。
　　 结果:
　　 1.显微镜观察细胞形态改变
　　 培养初期，相差显微镜下实验组与对照组细胞生长无明显差别，细胞均成纤维样生长，有一定的方向性，集落呈旋涡状和火焰状，但实验组细胞生长较旺盛。培养中期，实验组原长梭型细胞逐渐变圆，细胞集落间相互融合成单层，长满整个培养瓶，细胞排列呈平行状或漩涡状。对照组细胞到培养后期原长梭型细胞仍为梭形，但细胞质折光性差，考虑为老化现象。培养后期，传代培养的细胞生长速度较原代培养明显增快，不再形成细胞集落，4-5d即可铺满瓶底。
　　 2.目标细胞的增长总数
　　 培养第7天，实验组细胞总数（106个）总数为12.01±0.30，对照组则为5.12±0.26;培养第14天，实验组细胞总数（106个）总数为18.05±0.28，对照组则为7.05±0.23。
　　 3.骨髓源性肝干细胞各个亚群的数量变化
　　 表达CD90、CD105、CD117、CD184、CD326的人BMDLSC各亚群的数量变化在第7天分别为4.94、4.89、6.70、5.72、5.03倍，及第14天数量增长倍数为7.60、7.76、11.70、21.38、8.12倍。实验组中的各个亚群均有稳步的增长，其中以CD184的增加最为明显。
　　 结论:
　　 1.培养细胞总数的稳定增长表明，TPO+HGF+IL-3组合培养方案是稳定的纯化、培养并有效扩增骨髓源性肝干细胞的方法，此方案能够有效增加人骨髓源性肝干细胞的数量，解决了临床应用细胞移植所遇到的细胞数量不足的问题，为进一步开展肝干细胞移植提供了方便。
　　 2.骨髓源性肝干细胞可以作为肝组织工程重要的种子细胞来源。骨髓源性肝干细胞容易获得，操作较为方便，体外培养易于存活，皆使之成为组织工程学中优良的种子细胞。
　　 3.五个骨髓源性肝干细胞亚群(CD90、CD105、CD117、CD184、CD326)在此方案的培养下虽然增长倍数不同，但是均有显著的增长，其中以表达CD184的亚群增加最为明显。表明，CD184亚群对TPO+HGF+IL-3组合培养方案最为敏感，增长效果最好，但具体机制尚不明确。

目录

摘要

前言

人骨髓源性肝干细胞的分离和培养

材料与方法

结果

讨论

结论

骨髓源性肝干细胞各亚型的扩增情况

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述 骨髓源性肝干细胞的研究进展

硕士期间发表的文章

致谢

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