慢性心力衰竭尿液蛋白标记物的筛选、鉴定及应用研究

摘要

研究背景：慢性心力衰竭(CHF)是由于心脏器质性或者功能性疾病损害心脏射血和充盈能力而引起的一组临床综合征，以心功能不全、神经内分泌激活和外周血流分布异常为主要特征。慢性心衰是各种病因导致心血管疾病的严重阶段，其患病率高，死亡率大，5年存活率与恶性肿瘤相仿，严重威胁着患者生命并严重影响患者生活质量，高额的治疗费用给社会经济造成了巨大的负担，成为一个严重的公共卫生问题。缺乏客观诊断标准是心衰死亡率高的原因之一，慢性心力衰竭至今尚无诊断的“金标准”，诊断心衰很大程度取决于医生个人临床判断，主要依据临床症状和体征。目前公认的NYHA分级是最常用的评价心衰严重程度，预测心衰预后的心功能分级系统，但其评价依据是以病人自觉症状为主，其诊断的准确率受到医生进行临床判断的主观影响，同时也与医生的从医经验和患者的配合度相关。目前无创的客观检查手段如超声心动图所能检测的LVEF虽有较大诊断价值，但只能起参考作用。寻找能够反映心衰这一病理生理状态的客观指标是当前面临的主要问题。心衰是一种慢性和发展性疾病，促发心衰的因素有很多，根据神经激素学说及炎性细胞学说，我们找到了以BNP/NT-proBNP，炎症细胞因子（如C反应蛋白，肿瘤坏死因子-α），心肌损伤标记物（如肌钙蛋白）为代表的一系列新的标志物，推动了整体心血管疾病诊治水平的提高;因此有必要在生命活动的直接执行者蛋白质领域上，寻找敏感性高、特异性好的蛋白生物分子标志物。心力衰竭可由多种病理因素引起，在病理情况下蛋白质的变化也是多种多样的。心力衰竭直接相关的分子和细胞改变与临床上心功能受损、疗效、衰竭进程和患者预后的关系并没有确定，不同病因引起的心力衰竭疾病过程，临床表现，预后也有差异，这些差异必然是由其不同的蛋白质特征决定的。直接对心力衰竭过程中蛋白组学的研究是揭示细胞生命本质特征的重要方案，有助于了解心衰时心肌细胞功能障碍及代偿作用的分子机制。本研究采用荧光差异双向凝胶电泳(2D-DIGE)蛋白质组学方法结合质谱技术筛选并鉴定慢性心力衰竭和正常人群尿液差异表达蛋白质，并对候选差异表达蛋白质进行验证及进一步的研究。探讨慢性心衰的发生发展机制，寻找慢性心衰特异性分子标记物，为其早期诊断，监测预后及寻求新的治疗靶点提供研究依据。
　　 第一部分慢性心力衰竭患者尿液双向凝胶电泳图谱的构建
　　 1.目的:构建稳定性好，重复率及分辨率高的慢性心力衰竭尿液蛋白双向电泳图谱，为尿液蛋白组水平进一步研究慢性心力衰竭奠定基础。
　　 2.材料和方法:随机选取慢性心力衰竭患者9例，其中心功能分级Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ级的心衰患者各3例。标本来源于南方医科大学南方医院心血管内科，明确诊断为慢性心衰的患者。患者纳入标准按照Framingham Heart Study(FHS)的慢性心力衰竭诊断标准。慢性心衰患者心衰严重程度按照美国纽约心脏学会(NYHA)分级法分级。嘱咐符合纳入标准的患者留取入院后前两天清洁中段晨尿，留取后立即冷却4℃，随后移到-80℃储存。将尿液样本用丙酮或TCA/丙酮沉淀法提取，纯化，浓缩蛋白，并用2D-Quant方法测定蛋白质浓度。随后按照双向电泳手册进行操作。上样样品分为四组:取100μg蛋白样品丙酮处理组(IPG pH3-10NL，24cm)，100μg蛋白样品TCA/丙酮处理组(IPG pH3-10NL，24cm)，100μg蛋白样品聚焦60 KVh组(IPG pH3-10NL，24cm)和100μg蛋白样品聚焦50 KVh组(IPG pH3-10NL，24cm)。第一向为等电聚焦，聚焦完毕后用平衡液平衡两次，随后胶条移至浓度为10.0％的SDS-PAGE胶上端进行二向电泳，直至溴酚蓝达胶底线。按照固定、敏化、水洗、银染、水洗、显色、终止的步骤对电泳胶染色。用投射扫描仪进行胶图扫描，获取2-DE凝胶图像。
　　 3.结果
　　 1)对比聚焦总伏特数50 KVh组;聚焦总伏特数60 KVh组的电泳图谱上不仅蛋白点较多，而且横条纹也大大减少，分离效果较好。
　　 2)使用TCA/丙酮沉淀法较丙酮沉淀法的整个图谱效果明显好，背景干净，清晰，图谱的横，竖条纹均较少，且图上的蛋白质点能够清晰分辨，以便进行差异点的辨认和鉴定等后续实验。
　　 4.结论:尿液样本采用TCA/丙酮沉淀法处理，第一向电泳聚焦60KVh的总伏特数能够得到稳定性好，分辨率高、重复性好的双向电泳图谱，为进一步从尿液蛋白组水平筛选出慢性心力衰竭相关蛋白研究奠定了实验基础。
　　 第二部分慢性心力衰竭患者尿液表达变化蛋白质的分离、筛选及鉴定
　　 1.目的:利用2D-DIGE和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴定技术对慢性心力衰竭组和正常对照组尿液中的差异蛋白质进行分离，筛选及鉴定，为进一步寻找敏感性高、特异性好的慢性心衰蛋白生物分子标志物奠定基础。
　　 2.材料和方法:本部分研究共纳入正常对照组和慢性心力衰竭组尿液标本各15例，其中心功能分级为Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ级的心衰患者各5例。慢性心力衰竭患者尿液标本收集同第一部分。正常对照组标本来源于南方医院体检中心健康受试者的清洁中段晨尿。入选标准为:既往体健，无长期服药史，无重大疾病史的志愿者，无近期感染史，无吸毒及嗜酒史。采用标本混合法，提取两组尿液总蛋白并定量后进行荧光染料标记，Cy2标记内标样品，Cy3标记正常对照组尿液蛋白样品，Cy5标记慢性心力衰竭尿液蛋白样品。待样品标记好后进行双向电泳过程。电泳结束后，标记有荧光染料的凝胶直接用Typhoon9410扫描仪扫描，获取图谱后用Decyder凝胶分析软件进行分析。挑选出28个两组间具有统计学意义(P＜0.05)并且差异倍数＞1.5倍的显著增加或者显著减少的感兴趣差异蛋白点进行质谱鉴定。利用考马斯亮蓝染色的制备胶上对应的差异点进行质谱鉴定。
　　 3.结果
　　 1)成功利用荧光差异双向电泳方法对慢性心力衰竭和正常对照两组的尿液蛋白进行分离，筛选并获得满意的荧光差异双向电泳图谱。
　　 2)运用Decyder凝胶分析软件对分析后，挑选出慢性心力衰竭和正常对照两组28个差异倍数＞1.5倍的差异蛋白点作为质谱鉴定的对象。
　　 3)共鉴定出20种不同的蛋白质。在慢性心力衰竭组中7个升高表达的蛋白分别是:钙粘蛋白-1(CDH1)，锌α2糖蛋白(AZGP1)，α1-酸性糖蛋白(ORM1)，人α1微球蛋白(AMBP)，免疫球蛋白1κ链C区(IGKC)，人免疫球蛋白轻链kappa(IGLC1)，GM2神经节苷脂激活因子(GM2A);13个下调表达的蛋白分别是:尿调节素(UMOD)，激肽原-1(KNG1)，α1-淀粉酶(AMY1A)，维生素D结合蛋白(GC)，胰腺α-淀粉酶(AMY2A)，血清白蛋白(Serum albumin，ALB)，白细胞弹性蛋白酶抑制剂(SERPINB1)，间-α-胰蛋白酶抑制剂重链H4(ITIH4)，凝血酶原(F2)，钙结合蛋白(CALB1)，硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白(HSPG2)，甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶2(MASP2), CD59糖蛋白(CD59)。
　　 4.结论:顺利利用荧光差异双向电泳对慢性心力衰竭和正常对照两组的尿液蛋白进行分离，筛选及分析差异蛋白点，并成功鉴定出20种不同的蛋白质，7个蛋白质在慢性心力衰竭尿液中高表达，13个低表达。为寻找敏感性高、特异性好的慢性心衰潜在的蛋白生物分子标志物提供了重要的研究基础。
　　 第三部分差异蛋白ORM1在慢性心力衰竭的临床意义研究
　　 1.目的:在鉴定的20个差异蛋白中选取与慢性心力衰竭特异相关的尿液候选蛋白，并研究该候选蛋白与慢性心力衰竭疾病的联系。
　　 2.材料与方法:首选利用生物信息学工具对鉴定的20个差异蛋白进行分析，系统、科学地分析这些鉴定蛋白质累积信息所蕴含的生物学意义。根据生物信息学分析选定ORM1为候选蛋白。利用western blotting技术验证ORM1在尿液中的表达，验证其可靠性后，对62例正常对照组和176例慢性心力衰竭患者的尿液标本用ELISA方法检测ORM1蛋白浓度，其中Ⅱ级患者34例，Ⅲ级患者87例和Ⅳ级心衰患者55例。标本来源于南方医科大学南方医院心血管内科，明确诊断为慢性心衰的患者。患者纳入标准按照Framingham Heart Study(FHS)的慢性心力衰竭诊断标准。慢性心衰患者严重程度按照美国纽约心脏学会(NYHA)分级法分级。正常对照组标本来源于南方医院体检中心健康受试者的清洁中段晨尿。定量检测后，运用ROC曲线分析尿液ORM1/Cr用来诊断慢性心力衰竭的临界值及对应的特异度和敏感度。此外，根据纳入ELISA研究慢性心力衰竭患者临床资料如:年龄，性别，伴有或无糖尿病，伴有或无高血压，伴有或无冠心病，伴有或无心肌病，伴有或无肾功能损害，eGFR分级，NT-proBNP和和LVEF≥或＜50％等进行分析，进一步分析ORM1与慢性心力衰竭之间的关系。
　　 3.结果
　　 1)生物信息学提示这20个差异蛋白共参与了1600个不同的生物学过程，其中前15个生物学过程包括:生长，诱导，信号转导，发病机制，分泌，消化，定位，翻译，凝血，死亡，RNA剪接，细胞凋亡，磷酸化和补体激活等。
　　 2)生物信息学分析及文献挖掘提示ORM1可作为候选蛋白进一步研究。
　　 3) ORM1尿液western blotting结果与蛋白质组学结果一致，在慢性心力衰竭中高表达。
　　 4)慢性心力衰竭组的ORM1/Cr水平为6498.83±4300.21 ng/mg，显著高于健康对照组2102.256±1069.24 ng/mg。当ORM1/Cr为2484.98ng/mg水平，用其诊断慢性心力衰竭的敏感度为90.91％，特异度为85.48％。
　　 5)慢性心力衰竭的严重程度分组，Ⅱ级，Ⅲ级和Ⅳ级心衰患者尿液中ORM1/Cr水平有显著性差异，浓度依次分别为:3086.24±1474.91 ng/mg，6284.97±4088.02 ng/mg和8946.71±4298.05 ng/mg; Spearman检验提示其相关系数为0.499，尿液中ORM1水平随着心衰程度的加重而升高。
　　 6)慢性心力衰竭患者临床资料的分析中，未发现年龄，性别，伴有或无糖尿病，伴有或无高血压，伴有或无冠心病，伴有或无心肌病，伴有或无肾功能损害，eGFR分级和LVEF≥或＜50％等分组中尿液ORM1蛋白浓度有显著差异。
　　 4.结论:ORM1蛋白在慢性心力衰竭患者尿液中表达升高，且与心衰严重程度呈正相关关系，尿液ORM1对慢性心力衰竭的诊断及监测有重要的意义，可作为一个尿液蛋白标记物，但其效能和机制需进一步研究。

目录

摘要

前言

参考文献

第一部分 慢性心力衰竭患者尿液双向凝胶电泳图谱的构建

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 慢性心力衰竭患者尿液表达变化蛋白质的分离、筛选及鉴定

一、材料

二、方法

结果

讨论

参考文献

第三部分 ORM1在慢性心力衰竭的临床意义研究

材料与方法

结果

讨论

参考文献

全文总结

发表文章

缩略语词汇表

攻读学位期间发表的论文

致谢

统计学审稿证明

声明