乳腺癌不同分子亚型差异表达microRNAs的综合分析及microRNA-9-5p功能研究

摘要

研究背景:
　　 乳腺癌已经成为威胁全世界女性生命健康的最主要杀手之一，在女性肿瘤中发病率排第一。随着对乳腺癌发病机制认识的深入以及有效的干预，乳腺癌的死亡率逐年下降，但仍在引起死亡的肿瘤中排第5位。长期以来，乳腺癌的治疗主要是在传统的组织学类型、临床和病理分期的基础上，选择相应的手术、化学药物、放射、内分泌或分子靶向等不同治疗手段。但乳腺癌的发病机制复杂，临床表现多样，不同乳腺癌在转移、复发、生存预后及治疗敏感性方面呈现出高度异质性。但传统的临床病理分期和分型远远不能满足肿瘤个体化治疗的要求。因此，对乳腺癌进的分子分型研究是乳腺癌防治研究中的工作重点。
　　 随着现代分子生物学的发展，基因微阵列等高通量检测技术，可以实现在基因组层面对不同乳腺癌差异基因表达状况进行分析。通过对乳腺癌临床样本进行全基因组表达谱检测，筛选出差异表达的基因，并对差异表达基因进行聚类分析，从而根据基因表达模式的不同，在分子层面将乳腺癌分为4种分子亚型，包括Luminial型，Basal型，HER2+型和Normal型。研究发现，不同的基因表达模工可能是导致乳腺癌表型多样性的原因。而不同分子亚型乳腺癌之间，不但表现出基因表达模式的差异，而且在肿瘤生物学行为、瘤体生长速度、特定信号通路活性及肿瘤的细胞组分方面存在显著差异。
　　 乳腺癌分子分型可以在传统临床病理分期、分型的基础上更有效地指导治疗，但是，无论是基于全基因组表达谱还是免疫组化检测的分子分型方法，目前均不能对乳腺癌亚型的多样性进行完整、准确、清楚的描述和定义。因此，研究人员仍在积极寻找新的乳腺癌分子标签，期望深入理解乳腺癌表型异质性的产生原因。MicroRNA(miRNA)是一类长约22 nt的内源性非编码的单链微小RNA分子，通过特异性靶向信使RNA(mRNA)实现对mRNA的剪切或转录后抑制，从而在基因表达过程中发挥重要的调节功能。miRNA通过调节原癌基因或抑癌基因的表达参与各种实体肿瘤和血液肿瘤发生发展的多个过程，日益成为一种新的肿瘤分子标签。通过对乳腺癌组织和正常乳腺组织之间miRNA表达情况的检测，发现miRNA不但可以作为分子标签区分乳腺癌组织和正常组织，而且差异表达的miRNAs与乳腺癌的ER状态、PR状态、肿瘤分期、淋巴结转移、血管侵袭和增殖指数等生物学特性密切相关。随后的研究表明，根据不同乳腺癌组织的miRNA表达谱，同样可以将乳腺癌在分子层面分为LuminalA、Luminal B、Basal、HER2+及Normal等不同亚型，提示miRNA可以作为乳腺癌的一种分子标签。
　　 在不同分子亚型的乳腺癌中，差异表达的miRNAs可能通过调节不同靶基因发挥不同的生物学功能，进一步研究miRNA的功能有助于深入理解乳腺癌分型异质性。对miRNA功能的研究依赖于其靶基因的确定。miRNA短序列特性导致单个miRNA可以靶向结合多个目的基因，同时单个目的基因可以被多个miRNA靶向结合。因此可以推测，不同分子亚型乳腺癌之间差异表达的miRNA与靶基因之间必然形成错综复杂的网络式调控关系。
　　 研究目的:
　　 本课题拟分析不同分子亚型乳腺癌之间miRNAs差异表达情况，建立一种对差异表达miRNA生物学功能和相关信号通路进行综合分析的方法，探讨差异表达miRNA在不同分子亚型乳腺癌之间可能发挥的调节作用，并在乳腺癌细胞株中对差异表达的miRNA功能进行初步的实验研究，以期为深入理解乳腺癌不同分子亚型异质性的相关机制提供实验数据。
　　 研究内容:
　　 研究内容主要分为以下三个部分:
　　 第一部分:不同ER表达状态乳腺癌之间差异表达miRNA的功能和相关信号通路分析。
　　 方法:通过文献挖掘，找出ER(+)/ER(-)乳腺癌差异表达的miRNA，利用靶基因预测软件TargetScan、PicTar及miRanda分别预测miRNA的靶基因，并在TarBase数据库中获取实验验证的miRNA靶基因。然后将不同来源的靶基因合并取并集。对得到的靶基因集进行“两步法”富集分析，主要包括乳腺癌组织特异性表达基因富集和Gene Ontology(GO)生物学过程(biological processes，BP)富集，去除随机化因素产生的靶基因。对富集分析后得到的靶基因集，利用DAVID数据库进行相关生物学功能和信号通路分析。
　　 结果:在ER(+)/ER(-)乳腺癌之间，总共筛选到了5个差异表达的miRNA数据集，分别包含了11、43、25、6及19个miRNA。经过靶基因预测及富集分析后，不同miRNA靶基因集分别包括1553、1750、1905、1250和1826个基因。进一步功能及通路分析发现不同的miRNA靶基因集主要参与转录相关、蛋白质定位及转移、RNA代谢、细胞周期、细胞凋亡、细胞分裂等多个生物学过程，并发现不同miRNA的靶基因集共同参与3条BIOCARTA细胞信号通路，分别为CARM1和雌激素受体调节通路、ERBB2在信号转导及肿瘤的作用通路和蛋白酪氨酸磷酸酶α对SCR基因激活通路。
　　 结论:在5组差异表达的miRNA集中，发现不同实验来源的miRNA集之间重合性差，表现为包含的miRNA数目及组成差异明显，而本研究建立的综合分析方法，通过“两步法”富集分析可明显减少非特异性靶基因数目，实现对不同实验来源的差异miRNA进行综合分析，有助于理解差异表达miRNA可能发挥的共同作用机制，有利于指导进一步的实验研究方向。功能分析发现差异表达miRNA可能广泛参与细胞各个过程，结合文献复习表明，获取的3条BIOCARTA信号通路与ER表达调节密切相关，值得继续深入研究。
　　 第二部分:为排除乳腺癌分子指标HER2、Ki-67等混杂因素对miRNA表达谱的影响，在基于基因表达谱对乳腺癌分子分型的基础上，利用第一部分建立的综合分析方法，进一步对Basal型和Luminal A型乳腺癌差异表达miRNA进行了分析及相关生物学功能研究。
　　 方法:从公共基因芯片数据库CEO中筛选Basal型和Luminal A型乳腺癌miRNA表达谱数据，并要求乳腺癌分子分型的确定是基于基因表达谱检测而非免疫组化检测方法。利用BRB-arrayTools软件分析筛选出差异表达的miRNA。对差异表达的miRNA，利用TargetScan和miRDB靶基因预测软件分别预测得到miRNA的靶基因，并将两部分来源的靶基因取交集，然后与TarBase数据库中获得的实验验证过的靶基因合并取并集。对获取的靶基因集，同样利用DAVID数据库进行GO功能和相关信号通路分析。
　　 结果:在GEO数据库筛选获得了登录号为GSE19536原始miRNA微阵列表达数据，包括41例Luminal A型和15例Basal型乳腺癌。Luminal A型和15例Basal型乳腺癌分子亚型根据两种不同的基因表达模式确定，符合研究要求。BRB-arrayTools软件对miRNA微阵列数据进行分析，Basal型和Luminal A型乳腺癌之间差异表达的miRNA共有54个(P≤0.001)。相对于Luminal A型乳腺癌，共有31个miRNA在Basal型乳腺癌中上调表达，23个miRNA下调表达。靶基因预测后，上调和下调表达miRNA的靶基因集数目分别为4916和3217个，分别命名为L1和L2。对L1和L2靶基因集的GO功能分析表明，两个靶基因集分别在不同的生物学过程富集显著，L1富集最显著的GO BP分类为蛋白运输、蛋白定位及代谢过程的正向调控作用;而L2富集最显著的GO BP分类为细胞周期、细胞粘附及血管发生及形成。KEGG通路分析分别涉及了35条和39条(P≤0.05)，L1富集最显著的KEGG通路包括胞吞通路、神经营养蛋白通路、泛素介导蛋白水解通路、肿瘤相关通路、MAPK及P53信号通路;而L2富集最显著的KEGG通路则主要集中在肿瘤相关通路及粘着斑通路。BIOCARTA通路分析则分别涉及5条和9条（P≤0.05），同样，L1和L2分别富集在不同的信号通路。
　　 结论:本部分研究获得了Basal型和Luminal A型乳腺癌差异表达的miRNA集，通过检测差异表达的miRNA能够很好地实现对不同乳腺癌进行分子分型，因此，差异表达miRNA可以作为区分Basal型和Luminal A型乳腺癌的分子指标。功能分析表明差异表达miRNA在两种分子亚型乳腺癌之间参与调节的生物学过程及信号通路明显不同，可能部分解释Luminal A型和Basal型乳腺癌不同的生物学特性和临床表现。
　　 第三部分:在第二部分研究分析基础上，从得到的Basal型和Luminal A型乳腺癌差异表达的miRNA中挑选差异表达显著的miR-9-5p进行初步功能研究。
　　 方法:选用乳腺癌细胞株MCF-7、MDA-MB-231、T47D及人正常乳腺上皮细胞MCF-10A作为研究模型，荧光定量PCR方法检测4种细胞株中miR-9-5p的表达情况。化学合成miR-9-5p的模似物(mimic)和抑制物(inhibitor)，并瞬时转染miR-9-5p mimic和inhibitor进入乳腺癌细胞株，检测miR-9-5p表达情况。分别利用MTT染色法、PI单染结合流式细胞术、Annexin V-FITC、PI双染色结合流式细胞术检测miR-9-5p过表达或抑制表达对乳腺癌细胞株增殖、细胞周期分布及细胞凋亡的影响。利用划痕实验、transwell迁移和侵袭实验检测miR-9-5p过表达对乳腺癌细胞株的迁移和侵袭能力的影响。利用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析miR-9-5p过表达对乳腺癌细胞株MCF-7蛋白质表达谱的影响。
　　 结果:4种细胞株中的miR-9-5p表达情况并不相同，在3种乳腺癌细胞保的表达均低于正常乳腺上皮细胞中的表达，统计学分析具有显著性（F=51.307，P＜0.001）。进行多重比较后，发现3种乳腺癌细胞与正常乳腺细胞之间的miR-9-5p表达差异显著;并且miR-9-5p在MCF-7细胞中的表达低于MDA-MB-231，表达差异具有统计显著性(P＜0.05)。与miR mimic NC作对照，在MCF-7和MDA-MB-231细胞株中分别瞬时转染miR-9-5p mimic后，miR-9-5p的表达量分别增高了约300倍(t=-50.503，P＜0.001)和100倍(t=-63.598，P＜0.001)。而与miR inhibitor NC作对照，瞬时转染miR-9-5p inhibitor后，miR-9-5p的表达量分别降低了约65％(t=10.317，P＜0.001)和70％(t=15.473，P＜0.001)。与对照组相比，转染miR-9-5p mimic后，MCF-7和MDA-MB-231细胞在不同时间点细胞生长速度呈下降趋势;而转染miR-9-5p inhibitor后，两种细胞在不同时间点生长速度呈上升趋势。与对照组相对，MCF-7细胞过表达miR-9-5p后，处于G1期的细胞比例增高约18％(t=29.994，P＜0.001)，而处于S期细胞比例降低约15％(t=-29.424，P＜0.001);而MCF-7细胞转染miR-9-5p inhibitor下调表达miR-9-5p后，各个细胞周期分布未见显著变化(P＞0.05)。在MCF-7细胞中过表达miR-9-5p后，PI单染色结合流式细胞术检测未发现凋亡峰，进一步Hoechst33258染色未观察到增多的凋亡现象，而Annexin V-FITC、PI双染色结合流式细胞术检测表明，早期凋亡率轻微增加约6％(t=2.953，P=0.042)，晚期凋亡率未见显著变化(t=-2.289，P=0.084)。划痕实验观察到MCF-7细胞过表达miR-9-5p后，细胞迁移速度变慢。在MDA-MB-231细胞过表达miR-9-5p后，细胞穿孔迁移能力减弱(t=10.823，P＜0.001)，侵袭能力同样减弱(t=6.116，P＜0.001)，穿过的细胞数目减少。对过表达miR-9-5p的MCF-7细胞蛋白表达情况进行2D-PAGE和MALDI-TOF MS分析鉴定，共成功鉴定11个差异表达蛋白。相对于对照组，miR-9-5p过表达后引起8个下调表达的蛋白包括:OTUB1、PP4C、EIF3K、DCNL1、COPZ1、SSRD、SAHH和GNAS2;3个上调表达的蛋白:HSPB1、TSG101和B2MG。
　　 结论:miR-9-5p在乳腺癌细胞中的表达低于正常乳腺上皮细胞，ER阳性乳腺癌细胞中的表达低于ER阴性乳腺癌细胞。miRNA-9-5p过表达可能主要通过阻滞细胞周期G1期机制引起乳腺癌细胞增殖能力减弱，而与细胞凋亡关系不明显。而miRNA-9-5p过表达引起细胞迁移和侵袭能力减弱，同样提示miR-9-5p可能主要通过抑制肿瘤细胞迁移和侵袭机制发挥抗肿瘤作用。OTUB1、PP4C和EIF3K等下调蛋白的基因可能受到miR-9-5p的直接调控，进而通过影响细胞增殖、迁移和转移等信号通路参与乳腺癌发病机制。而HSPB1、TSG101和B2MG等蛋白的上调表达可能间接受到miR-9-5p调节，同样参与肿瘤发生发展。

目录

摘要

前言

第一章 不同雌激素受体表达状态乳腺癌差异表达miRNAs的相关信号通路分析

引言

1．1 材料

1．2 实验方法

1．3 结果

1．4 讨论

第二章 Basal型和Luminal A型乳腺癌差异表达miRNAs分析及相关生物学功能研究

引言

2．1 材料

2．2 实验方法

2．3 结果

2．4 讨论

第三章 MicroRNA-9-5p相关功能的初步研究

引言

3．1 材料

3．2 实验方法

3．3 结果

3．4 讨论

全文小结

参考文献

英文缩写词表

博士攻读期间研究成果

致谢

声明

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