U87-EGFRvⅢ细胞适配子的筛选及其介导siRNA转运的初步应用

摘要

恶性多形性胶质瘤（glioblastoma multiforme，GBM）是最常见的恶性脑肿瘤，预后非常差:成年病人1、3或者5年的生存期的概率大约分别为＜30％、＜5％、＜3％。在20％～30％的GBM病人中存在人表皮生长因子受体(epidermal growthfactor receptor，EGFR)及其常见的Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)的异常表达，有研究证明其表达变化与GBM的恶化及放、化疗抗性有密切关系;在其它恶性肿瘤如非小细胞肺癌、大肠癌、结肠癌等中均存在不同程度的EGFR及EGFRvⅢ的高表达。因此EGFR及其突变体可以作为肿瘤治疗的主要靶标。目前，EGFR单克隆抗体已经应用于临床治疗，这种抑制剂阻断EGFR受体，使得EGFR的酪氨酸激酶信号通路失活，从而抑制肿瘤细胞的增殖和迁移。由于抗体药物本身的免疫原性，且EGFR在正常组织中也表达， EGFR单克隆抗体的应用出现了许多不良反应、长期使用易出现耐药性，因此开发靶向性强、免疫原性小、分子量小、毒性小、稳定好的制剂更为重要。另有研究表明EGFRvⅢ仅在肿瘤组织中表达，可作为高特异性的治疗靶标;而核酸适配子技术的发展为新的抗肿瘤药物的研发提供了可能。
　　 适配子(aptamer)是能形成特定的三维空间结构的寡核苷酸，以高亲和力和高特异性与靶分子结合。与传统的抗体相比，适配子有如下特征:分子量小，可在体外快速合成，易于化学修饰;稳定性好便于长期储存;毒性低，免疫原性小;有较快较好的组织渗透性。这些优点使得适配子可用于疾病的诊断和治疗。适配子可通过指数富集配基的系统进化技术(systematic evolution of ligandsby exponential enrichment，SELEX)在容量为1013-1015的随机寡核苷酸文库中筛选得到。
　　 近几年有研究报道筛选出更复杂靶分子的适配子，如细胞膜蛋白、全细胞和细菌等。相比protein-SELEX，基于细胞的cell-SELEX技术不需要纯化或者固定靶分子蛋白，且靶分子或者靶蛋白能在活性状态下维持细胞表面正常的空间结构和糖基化位点，这样易于筛选出肿瘤细胞表面的新的靶分子或靶蛋白，对肿瘤标记物的发现有重要意义。
　　 本研究利用cell-SELEX技术，以稳定过表达EGFRvⅢ的U87细胞(U87-EGFRvⅢ细胞)作为靶分子，从体外合成的含30个随机序列的寡核苷酸文库中筛选出与U87-EGFRvⅢ细胞高亲和力、高特异性结合的适配子。利用经典ELISA的方法和生物素-链亲和素系统，建立并进行细胞酶联反应(cellenzyme-linked assay，cell-ELA)实验来测定适配子与U87-EGFRvⅢ细胞的亲和力;利用共聚焦显微镜检测技术寻找能被U87-EGFRvⅢ细胞表面受体介导内吞的适配子，并用此适配子作为一种传递c-Met siRNA进入细胞介导基因沉默的工具。
　　 首先，建立稳定过表达EGFRvⅢ的细胞株U87-EGFRvⅢ，同时体外构建合成两端为固定序列、中间为30个nt的随机序列、全长为76个nt的ssDNA文库。以贴壁培养过夜的U87-EGFRvⅢ细胞为靶标，经过孵育、洗涤、分离后，通过不对称PCR法分离单链ssDNA，大量扩增得到下轮筛选的亚库。筛选过程中不断增加筛选的强度（如增加鲑精DNA量、缩短孵育时间、增加洗涤强度等）。从第四轮筛选开始，每轮引入EGFRvⅢ蛋白表达阴性的U87细胞作为反筛细胞，以去除细胞表面相同受体或者结构的干扰，经过14轮cell-SELEX筛选和鉴定，得到与U87-EGFRvⅢ细胞高亲和力、高特异性结合的适配子。
　　 用生物素标记的上游引物对所筛选的亚文库进行不对称PCR扩增，得到生物素标记的ssDNA。cell-ELA的方法检测筛选亚文库对U87-EGFRvⅢ细胞和U87细胞的结合力，在细胞数目和投入的ssDNA的量相同的条件下测定吸收度，从而判断出筛选过程中结合到U87-EGFRvⅢ细胞上的ssDNA的富集情况。
　　 将第14轮的筛选产物进行扩增、纯化、T载体克隆、“蓝-白”斑筛选并测序，得到相应适配子的序列，并用RNA STRUCTURE5.2软件预测DNA的二级结构，并将这些结构进行分类，根据序列的相似性挑选出进行后续功能研究的适配子。
　　 为了鉴定适配子的特异性和亲和力，用FITC标记适配子，然后与U87-EGFRvⅢ细胞孵育结合，于荧光显微镜下观察结合情况;用流式细胞技术测定各个FITC标记的适配子与U87-EGFRvⅢ细胞的亲和特异性;建立基于适配子的cell-ELA检测方法，测定相关数据，在Sigmaplot12.0软件中通过非线性回归分析获得适配子的解离常数。
　　 共聚焦显微镜定位观察适配子与U87-EGFRvⅢ细胞的结合位点，寻找能被细胞膜受体内吞的适配子。以链亲和素磁珠-pull down实验寻找适配子的具体分子靶标，即链亲和素磁珠和生物素标记的适配子孵育后，再与U87-EGFRvⅢ细胞蛋白提取物孵育。此时，与生物素标记的适配子有相互作用的蛋白被固定在磁珠-适配子复合物上，通过SDS-PAGE胶分离，在PVDF膜上用EGFR抗体来显影，若适配子能与EGFRvⅢ受体结合并发生作用，那么显影的结果将会有EGFRvⅢ蛋白145KD条带。验证此种适配子能介导c-Met siRNA的传递从而进入细胞内来抑制c-Met基因的表达。用脂质体lipofectamine2000转染siRNA作为对照，Western blot实验分析c-Met蛋白表达情况。
　　 结果显示:随着cell-SELEX筛选轮数的增加，ssDNA亚库与U87-EGFRvⅢ细胞结合的吸收度逐渐增加，第12轮、14轮与原库相比吸收度升高，有显著性差异(P＜0.05)。至第14轮，ssDNA与U87-EGFRvⅢ细胞的结合达到基本饱和状态，说明ssDNA文库在14轮已有一定的富集程度。将14轮得到的ssDNA克隆测序，序列用RNA Structure5.2软件分析:克隆测序结果中序列的二级结构都以茎环、发夹结构为主，其中共有10个序列出现两次以上的重复。在这10个序列中随机挑出5个序列(A41、A43、A32、A47、A15)进行FITC荧光或者生物素标记后进一步分析。
　　 在荧光显微镜下观察序列与U87-EGFRvⅢ、U87以及HEK293三种细胞的结合情况，在U87-EGFRvⅢ细胞中观察到较强的绿色荧光，而其它细胞均观察不到荧光。观察发现FITC标记的适配子A41、A32的绿色荧光集中在U87-EGFRvⅢ细胞核内，与DAPI的蓝色光重合。为进一步验证这一观察结果，用共聚焦显微镜观察A43、A41、A32、A47适配子在U87-EGFRvⅢ细胞的定位，确认A41、A32的荧光主要聚集在细胞核中，而其它适配子的荧光主要集中在细胞膜的表面。初步推测A41、A32适配子入核的原因可能是被细胞膜蛋白EGFRvⅢ或者其它膜受体内吞所致。Cell-ELA方法测定适配子A43、A41、A32、A47、A15的解离常数值(Kd)分别为:4.40±0.27nM，37.57±6.01nM，0.62±0.04nM，3.33±0.39nM，14.09±2.95。解离常数均在100nM范围内，其中A32的亲和力最高，其亲和力接近同体系测定的EGFR抗体对U87-EGFRvⅢ细胞的亲和力(Kd=0.32±0.07 nM)。通过pull-down实验及Western blot鉴定发现，与A32结合的靶标为U87-EGFRvⅢ细胞中的EGFRvⅢ蛋白。
　　 较多研究报道GBM病人中c-Met的过表达或异常表达与肿瘤的恶化和预后密切相关。肿瘤标志物c-Met是酪氨酸激酶受体，其主要的配基为肝细胞生长因子(HGF)，HGF/c-Met不仅可以影响胚胎组织的发育和分化，而且可以通过细胞周期、细胞粘附性、细胞迁移侵袭及抗凋亡的改变而导致致瘤性、侵袭性增强，肿瘤血管生成加速。c-Met在复发性GBM(15/19)中的表达量明显高于原发性GBM（7/19，p=0.020）。复发性GBM病人中可观察到c-Met的高表达。
　　 鉴于上述发现，由于A32具有较高的亲和力和特异性，且初步认定其与U87-EGFRvⅢ结合的位点为EGFRvⅢ受体并能进入细胞。选择生物素标记的A32、生物素标记的c-Met siRNA、链亲和素三者连接进行细胞实验，用脂质体转染c-Met siRNA作为阳性对照组，分别转染48h、72h之后收集细胞进行Westemblot实验。结果显示:转染48 h后，c-Met siRNA终浓度为40 nM和80 nM时，A32非转染组和lipofectamin2000转染组中c-Met的蛋白表达量均未有明显下降，而在转染48 h后，c-Met siRNA终浓度为100 nM时，与阴性对照siRNA组相比，lipofectamin2000转染组（不加链亲和素）中c-Met的表达量明显减少，有显著性差异（0.524±0.04，p=0.08），lipofectamin2000转染组（加链亲和素）中c-Met的表达量明显减少（0.631±0.08，p=0.051）;c-Met siRNA投入终浓度为100nM时，72h干扰后，A32转染组中c-Met的表达量减少明显，与阴性对照siRNA组比有显著性差异（0.57±0.09，p=0.039），阳性对照组lipofectamine2000（不加链亲和素/加链亲和素）组中c-Met表达量也显著下降(p＜0.05)。实验证明:适配子A32能介导c-Met siRNA的传递进入U87-EGFRvⅢ细胞并引起c-Met基因沉默，从而影响c-Met蛋白的表达。可能由于适配子能在受体的内吞作用下进入细胞内并在链亲和素的作用下与siRNA连接起来并进入胞内来发挥siRNA作用，从而介导c-Met的基因沉默。实验数据显示适配子、链亲和素、siRNA三者连接起来的方法是可行的，链亲和素对细胞并无毒性且不影响c-Met蛋白的表达。
　　 本课题研究表明DNA适配子可作为一种经济适用、靶向性强的核酸载体，介导siRNA进入靶细胞或组织中来沉默靶基因，为siRNA治疗提供了可行的方法。同时U87-EGFRvⅢ细胞特异性适配子的筛选，对恶性多形性胶质瘤的诊断和治疗具有重要的意义，为今后寻找新的治疗靶点奠定了基础。

目录

摘要

第1章 针对U87-EGFRvⅢ细胞的适配子的筛选与鉴定

1 前言

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 统计学分析

3 实验结果

3．1 U87和U87-EGFRvⅢ细胞的鉴定

3．2 不对称PCR法制备ssDNA

3．3 ssDNA文库富集的cell-ELA检测

3．4 克隆测序后得到的重复序列

3．5 荧光测定筛选适配子的结合特异性

3．6 Confocal显微镜下观察适配子在U87-EGFRvⅢ细胞中的定位

3．7 流式细胞技术检测适配子对U87-EGFRvⅢ细胞的结合特异性

3．8 Cell-ELA法测定适配子对U87-EGFRvⅢ细胞的亲和力

3．9 链亲和素磁珠pull-down方法确定适配子A32的结合蛋白

第2章 U87-EGFRvⅢ特异的DNA适配子介导siRNA转运

1 前言

2 材料和方法

2．1 材料

2．2 实验方法

3 结果

3．1 适配子与siRNA形成稳定结合体

3．2 适配子A32介导siRNA转运从而导致基因沉默

讨论

小结

参考文献

综述 适配子介导的siRNA转运

论文发表情况

致谢

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