纳米转运系统介导的hTERT-siRNA和Bmi-1-siRNA对MCF-7细胞增殖及凋亡的影响

摘要

背景和目的：
　　乳腺癌是我国女性常见的恶性肿瘤，近年来发病率呈大幅度上升，在很多城市已占据女性恶性肿瘤的首位或第二位，并且年轻化趋势日趋明显。目前临床治疗乳腺癌仍面临着常规治疗失败以及肿瘤复发的难题。
　　Bmi-1（B cell-specific Moloney leukemia virus integration site-1）基因作为polycomb家族成员之一，在细胞周期调控，细胞永生化和细胞衰老中起着重要的作用。近年来，大量的研究表明，Bmi-1参与调节肿瘤细胞以及干细胞的自我更新和分化，在多种人类肿瘤，包括肺癌、卵巢癌、急性髓细胞性白血病、鼻咽癌、乳腺癌、神经母细胞瘤中高表达，这表明中Bmi-1可能在癌症的发生和发展中发挥重要的作用。
　　端粒酶(telomerase)是使端粒延伸的反转录DNA合成酶，端粒酶能以自身RNA为模板合成细胞分裂时所丢失的DNA，维持细胞端粒长度的稳定。端粒酶活性主要在转录水平上进行调节，因此人体端粒酶逆转录酶(human telomerasereverse transcriptase，hTERT)成为端粒酶活性调节的一个限速因素，与端粒酶的表达呈一致性。在人的正常体细胞中，端粒酶的活性受到严格的调控，只有在造血细胞、干细胞和生殖细胞等这些不断分裂的细胞之中，才可以检测到具有活性的端粒酶。端粒酶，特别是其催化亚基hTERT基因，在大约85-90％的肿瘤中处于过度活化的状态，并已成为一种被广泛接受的抗肿瘤疗法的靶基因。综合国内外研究现状，目前，运用siRNA干扰进行基因治疗可能是未来乳腺癌综合治疗中最有希望的有效手段之一。为解决小干扰RNA转染效率低、易被细胞内核酸酶降解的难题，国内外学者也做了许多大胆的尝试与研究。目前，一种新型的载体:脂质体-多聚阳离子-核酸复合物纳米微粒载体(Lipid-polycation-Nucleicacid, LPN)受到广泛的关注。纳米微粒载体是近年来用于肽类、蛋白质、寡核苷酸和治疗基因等生物大分子的新的转运系统。具有高效、无免疫原性、安全、廉价、可生物降解、稳定等其它基因载体不具备的优势，有望成为基因转运和基因治疗中应用潜力巨大的非病毒载体。多聚阳离子载体可缩合核酸分子形成纳米微粒，其中聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)是近年来研究最为广泛的多聚阳离子载体。PEI带有丰富的阳离子电荷，可缩合核酸成纳米大小的颗粒状物，有利于治疗性基因进入细胞内。脂质体用来包裹PEI/DNA(RNA)压缩体制成LPN，构建的LPN的结构类似于病毒，含有一个带有遗传物质的核和一个脂质外壳。可有效地保护核酸和阳离子聚合物组成的内核免受核酸酶的直接作用，脂质层可促进LPN与细胞膜的融合，并通过细胞的内吞或吞噬作用将所携带的目的基因导入细胞中。进一步提高了转染效率。
　　本实验将从细胞学层面进一步验证纳米转运系统介导的siRNA沉默Bmi-1与hTERT基因对乳腺癌细胞MCF-7增殖与凋亡及Bmi-1与hTERT表达的影响。运用纳米转运系统介导的Bmi-1-siRNA和hTERT-siRNA转染乳腺癌MCF-7细胞，采用Western blot和Real time-PCR检测各组乳腺癌MCF-7细胞中Bmi-1与hTERT的蛋白及mRNA的表达水平;采用MTT法检测各组细胞增殖情况;运用流式细胞术检测各组细胞凋亡情况。
　　目的:探讨纳米转运系统介导的siRNA沉默Bmi-1与hTERT基因抑制乳腺癌细胞MCF-7增殖、诱导其凋亡奠定理论基础。
　　材料和方法：
　　1脂质体转染MCF-7细胞筛选干扰Bmi-1及hTERT基因的最佳siRNA片段及最佳浓度
　　人乳腺癌MCF-7细胞在5％CO2、37℃培养箱中培养，在脂质体的介导下转染人乳腺癌MCF-7细胞，筛选出最佳转染浓度以及运用Real time-PCR技术筛选沉默Bmi-1和hTERT最佳siRNA干扰片段。
　　2制备LPN纳米微粒载体并运用MTT法检测其对细胞毒性
　　1)制备LPN纳米微粒载体。
　　2)原子力显微镜检测LPN纳米微粒载体形态。
　　3)凝胶阻滞实验检测LPN纳米微粒载体的抗酶切能力以及脂质体包封。
　　4)共聚焦显微镜检测细胞对LPN纳米微粒的摄入。
　　5) MTT法检测其对细胞毒性。
　　3纳米转运系统介导的siRNA沉默Bmi-1与hTERT基因抑制乳腺癌细胞MCF-7增殖、诱导其凋亡
　　1)取人乳腺癌MCF-7细胞分为七组:空白对照组、PEI组、Bmi-1 siRNA组(G1)、hTERTsiRNA组(G2)、Bmi-1 siRNA LPN转染组(G3)、hTERTsiRNA LPN转染组(G4)、hTERT+ Bmi-1 siRNALPN转染组(G5)。运用Western Blot技术检测各组细胞中Bmi-1和hTERT的蛋白表达。
　　2)使用上述分组采用Real time-PCR技术检测各组细胞中Bmi-1 mRNA和hTERT mRNA的表达。
　　3)使用上述分组采用MTT法检测各组细胞生长抑制率。
　　4)使用上述分组运用流式细胞术检测各组细胞凋亡的变化情况。
　　4统计学处理
　　使用SPSS17.0进行统计分析，检验水准α=0.05。
　　结果：
　　1.Real time-PCR技术筛选Bmi-1 siRNA和hTERT siRNA最佳特异性片段。在mRNA表达水平上，Bmi-1 siRNA-2转染组Bmi-1表达水平最低(P＜0.05)，后续实验使用Bmi-1 siRNA-2。hTERT siRNA-3转染组hTERT表达水平最低（P＜0.05），后续实验使用hTERT siRNA-3。
　　2.LPN纳米微粒载体形态，粒径与zeta电位、脂质体包封实验以及细胞对其摄入情况的测定均达到实验要求。通过MTT法检测LPN纳米微粒载体转染MCF-7细胞48h后的毒性实验结果表明:当siRNA浓度为15pmol转染效率最好且毒性最小。
　　3.Western Blot技术检测各组细胞中Bmi-1和hTERT的蛋白表达结果表明:hTERT+ Bmi-1siRNALPN转染组抑制表达最为明显(P＜0.01）。
　　4.Real time-PCR技术检测各组细胞中Bmi-1 mRNA和hTERT mRNA的表达表明:hTERT+ Bmi-1 siRNALPN转染组抑制表达最为明显(P＜0.01)。
　　5.MTT法检测24h、48h、72h各组细胞生长抑制率结果表明:hTERT+Bmi-1 siRNALPN转染组抑制细胞生长最为明显(P＜0.01）。
　　6.流式细胞术检测各组细胞凋亡的变化结果表明:hTERT+Bmi-1 siRNALPN转染组促进细胞凋亡最为明显(P＜0.01）。
　　结论：
　　纳米转运系统介导的siRNA沉默Bmi-1和hTERT可以有效地抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖并诱导其凋亡。

目录

声明

摘要

中英文缩写索引

前言

材料和方法

1 实验器材

2 实验方法

实验结果

讨论

结论

附图和清单

参考文献

综述 Bmi-1、hTERT在肿瘤中的研究进展

个人简历

致谢