白纹伊蚊miR-252对登革病毒E蛋白表达及登革病毒复制的调节作用

摘要

背景:登革病毒(dengue virus，DENV)是地理分布最广的虫媒黄病毒，按抗原性可分为DENV-1～DENV-4四个血清型，同一血清型内又可分成不同的基因型。登革病毒的基因组为单股正链RNA分子，具有感染性，分子量为3，800 kDa，约含11，000个碱基。在病毒基因组5'-UTR和3'-UTR之间为病毒的单一开放读码框架(open reading frame，ORF)，编码一个约含3400个氨基酸残基的、分子量约380kDa的聚蛋白分子。人感染登革病毒后根据临床表现严重程度，分为登革热(dengue fever, DF)、登革出血热(dengue hemorrhagic fever，DHF)、登革休克综合征(the dengue shock syndrome， DSS)。可传播登革病毒的蚊种主要为埃及伊蚊(Aedes aegypti，Ae.aegypti)和白纹伊蚊(Aedes albopictus，Ae.albopictus)。白纹伊蚊主要分布在亚洲热带、亚热带和部分温带地区，现已传播到北美、南美、欧洲和非洲大陆，对DENV-1～DENV-4均高度易感，在我国为登革的主要传播媒介。随着全球气候变暖、生态环境的恶化、虫媒分布区域的扩展，登革的流行范围和频率不断增加。近十年来，登革热在全世界的发病率提高了将近30倍，目前已波及全球100余个国家和地区，主要流行于非洲、南美洲、东南亚和西太平洋地区。自20世纪90年代以来，除海南、福建、浙江和江苏省有登革热爆发外，我国的登革热主要在广东省流行，已成为流行区域面临的社会公共卫生问题。
　　 microRNAs(miRNAs)是一类长度为～22核苷酸(nucleotide，nt)的内源性小分子非编码单链RNA，广泛存在于真核生物中，可在转录后水平调节基因的表达，参与调控发育、细胞增值与分化、细胞凋亡、脂类代谢、激素分泌、机体免疫以及肿瘤发生、病毒感染等生理及病理过程。动物细胞中绝大部分miRNA由RNA聚合酶Ⅱ转录生成miRNA初始转录产物(primary miRNA，pri-miRNA)，在Pasha/DGR8的协同下，核酸酶Drosha将pri-miRNA切割成miRNA前体(precursor miRNA，pre-miRNA)。pre-miRNA由Exportin-5蛋白从细胞核内运送至细胞质中，然后经胞质内核酸酶Dicer的切割而加工成～22nt的miRNA:miRNA*双螺旋结构。双螺旋结构中的miRNA*通常迅速被降解;另一条5'端稳定性较低的链即成熟的miRNA(mature miRNA)则与Argonaute(Ago)蛋白家族成员结合进入RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencingcomplex，RISC)。miRNA引导RISC结合靶mRNA后在胞浆中积聚于P小体(P body)内，miRNA可能在P小体中行使其基因沉默功能。经典的理论认为，miRNA能抑制基因的表达，miRNA利用其5'端2～8个碱基的“种子”序列(seedsequence)识别靶基因mRNA3'-UTR的互补序列，引起靶基因mRNA的降解或者是翻译抑制。但目前有研究发现miRNA的靶序列也可位于靶基因的5'-UTR区和编码区中，miRNA亦可增强基因的表达。
　　 近年的研究提示病毒与宿主在miRNA水平存在相互的调节作用。一方面病毒自身可编码miRNA，利用其促进病毒自身复制与潜伏并抑制宿主细胞抗病毒活性;另一方面宿主细胞编码的大量miRNAs，在调控自身基因表达的同时，可调控入侵病毒的复制。Lecellier等发现哺乳动物细胞的miR-32可抑制Ⅰ型泡沫病毒(primate foamy virus type1，PFV-1)的复制。Pedersen研究者通过序列互补分析发现5种受IFN-B调节的miRNA对HCV复制有明显抑制作用;细胞转染人工合成的miRNA类似物(miRNA mimic)混合物能使HCV mRNA水平显著下降，而转染相应的反义miRNA抑制剂(miRNA inhibitor)能降低IFN-B的抗病毒作用。Triboulet等人发现敲除Dicer或Drosha可明显增强Ⅰ型人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiency virus，HIV-1)感染者外周血单个核细胞(Peripheralbloodmononuclear cell，PBMC)中病毒的复制，提示细胞miRNA对HIV-1的复制具有负调节作用。Hariharan等研究发现5种人miRNA在HIV基因组中能找到靶标序列，miR-29a和miR-29b靶向nef基因，miR-149靶向vpr基因，miR-378靶向env基因，miR-324-5P靶向vif基因;这些靶序列在所有HIV病毒包膜序列中高度保守，提示细胞miRNA水平可能与HIV-1感染及病程相关。Yeung等应用基因表达谱芯片技术研究HIV感染的人T细胞中miRNA表达的变化，上述提到的5种miRNA水平显著下调，提示细胞miRNA在HIV病毒-宿主相互作用中起重要作用。宿主miRNA也可被病毒利用促进其维持潜伏或增进复制。Jopling和Roberts等发现肝细胞特异性丰富表达的miR-122可与HCV基因组5' UTR区的两个互补序列相互作用，增强HCV在肝细胞中的复制。宿主细胞的miR-342-5p和miR-10a(miR-10a*)可分别靶向柯萨奇病毒B组(Group B coxsackieviruses，CVB)的2C编码区和3D编码区，抑制或增强CVB的复制，提示宿主细胞miRNA可识别CVB靶基因编码区的互补序列，并在转录后水平调控病毒基因的表达，进而影响病毒的复制和增殖。
　　 蚊是非常重要的虫媒病毒传播媒介，目前仅有冈比亚按蚊、斯氏按蚊、埃及伊蚊、致倦库蚊以及白纹伊蚊鉴定出miRNAs。Winter等利用鸟枪克隆及生物信息学分析第一次证实了冈比亚按蚊18个miRNAs的存在。Mead等发现和鉴定了斯氏按蚊中的23个保守miRNAs和及4个新miRNAs。Li等发现了86个埃及伊蚊miRNA。Skalsky等采用高通量深度测序的方法从白纹伊蚊的C7/10细胞中鉴定出65个miRNA，从库蚊中鉴定出77个miRNAs。对蚊虫miRNAs的功能了解得非常有限，有研究表明病原体入侵可影响蚊miRNAs表达水平。Winter等发现冈比亚按蚊miR-34在疟原虫感染后表达量上调5倍，而miR-12和miR-281表达量下降3倍，敲除Dicer1和Ago1 mRNA后的冈比亚按蚊对疟原虫的易感性升高，提示疟原虫的感染可能与冈比亚按蚊miRNA的表达差异相关，miRNAs可能参与冈比亚按蚊抗疟原虫感染。Osei-Amo等发现Wolbachia病毒感染前后的埃及伊蚊细胞内的miR-12呈现表达差异，提示miR-12可能和病毒的感染相关。Sckaly等用西尼罗病毒感染白纹伊蚊C7/10细胞，miR-989和miR-92表达量没有明显变化，同样条件下感染库蚊，发现miR-989表达水平下调，而miR-92表达上调;提示蚊miRNAs表达差异可能与病毒感染有关。最近的研究证实埃及伊蚊的miR-375可通过抑制NF-kB转录因子的活性而增强DENV-2的感染。
　　 本课题组吴锦雅博士、郑培民硕士运用solex测序和Northern blot的方法在白纹伊蚊成蚊中检测到miRNAs，并检测到雌蚊经胸腔注射登革病毒后，蚊体内大量miRNAs出现表达差异，提示miRNAs可能在白纹伊蚊抗登革病毒感染中起调控作用。
　　 目的:我们在白纹伊蚊C6/36细胞中建立登革病毒蚊体外感染模型，期待通过了解登革病毒感染前后C6/36细胞中miRNAs表达水平的变化，挑选在C6/36细胞中表达量丰富并且在登革病毒感染前后变化幅度较高的miRNAs，预测其在登革病毒基因组中可能的靶标基因;测定miRNAs表达水平的变化对靶基因表达水平的影响，初步探讨蚊细胞内miRNA对登革病毒感染的调控作用，为登革病毒的防治提供一个新的思路。
　　 方法:建立白纹伊蚊C6/36细胞DENV-2感染模型，使用实时定量PCR(real timequantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)测定DENV-2感染前后C6/36细胞内miRNAs的表达差异。使用RNAhybrid软件预测3种我们感兴趣的miRNAs在DENV-2基因组中的靶标，选择在C6/36细胞中表达水平较高并在DENV-2感染前后表达量变化明显的miR-252，通过RT-qPCR/western blot测定C6/36细胞在转染miR-252人工合成的类似物(mimic)或者反义抑制物(inhibitor)后，其预测的靶基因—登革病毒包膜蛋白(envelop protein，E protein)RNA/蛋白表达水平的变化，了解miR-252在抗登革病毒感染中的作用。
　　 结果:白纹伊蚊C6/36细胞感染DENV-2后，细胞内miR-252表达水平增高。经配对t检验，与对照组比较，在感染后24小时(hour，hr)，miR-252表达水平增高3.2倍(t=-9.850，P=0.010)，在感染后72 hrs，miR-252表达水平增高2.1倍（t=-6.751，P=0.021）。在DENV-2感染的白纹伊蚊C6/36细胞细胞中转染miR-252 mimic，增强miR-252的表达(24 hrs，t=-89.337，P＜0.001;72hrs，t=-28.508，P=0.001)，可降低DENV-2 RNA的表达(72 hrs，t=24.319，P=0.002)，western blot显示E蛋白的表达受到抑制;反之，在DENV-2感染的白纹伊蚊C6/36细胞中转染miR-252 inhibitor，降低细胞内miR-252水平(24hrs，t=16.381，P=0.004;72hrs，t=33.680，P=0.001)，可增强DENV-2 RNA的表达(72 hrs，t=-43.250，P=0.001)，并可使E蛋白表达量增高。转染了miR-252inhibitor的C6/36 cells上清液中的DENV-2滴度明显增高，与阴性对照相比较，P=0.034;与mock相比较，P=0.019。将包含有与miR-252种子序列互补的E蛋白跨膜区克隆入海肾荧光素酶报告载体中，经方差分析检验，与对照组比较，miR-252mimic能降低报告载体荧光素酶的表达(F=40.454，P＜0.001)，提示miR-252和E蛋白基因中的互补序列存在相互作用。
　　 结论:现有的结果显示白纹伊蚊可能通过其编码的miR-252抑制登革病毒E蛋白的表达，从而影响登革病毒的复制与增殖。据我们所知，这是第一次报道白纹伊蚊miRNA对登革病毒编码基因的抑制作用。

目录

摘要

前言

第一章 登革2型病毒白纹伊蚊C6／36细胞感染模型的建立与鉴定

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

第二章 白纹伊蚊C6／36细胞及雌性成蚊在登革2型病毒感染前后microRNAs表达谱分析

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

第三章 白纹伊蚊C6／36细胞microRNAs靶标预测及生物信息学分析

1 所用软件

2 生物信息学分析方法

3 结果

4 讨论

小结

第四章 白纹伊蚊miR-252对登革病毒E蛋白表达登革病毒复制的调节作用

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

第五章 白纹伊蚊miR-252与登革病毒E蛋白靶标序列的相互作用

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

本研究成果

缩略词表

参考文献

附录

博士期间成果

致谢

声明

统计学证明