肝细胞癌中GPC3与Notch1相互关系的研究

摘要

研究背景和目的:
　　 原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)在临床上恶性程度较高，是影响人类健康的重大疾病之一。我国是世界上肝癌高发区之一，发病率为20.37/10万，位于常见肿瘤的第3位。每年全球肝癌的新发病人数有65万左右，其中一半以上发生在我们国家。而在亚洲，我们占了每年新发病人数的80％以上。虽然目前临床上可用于治疗肝癌的手段比较多，包括手术切除、肝移植、血管介入、消融技术、放化疗等，且在肝癌的药物治疗上取得重大突破，但手术切除仍被公认为肝癌获得根治的最好手段。然而，即使是根治性切除，5年内仍有60～70％的病人出现转移复发，而局部治疗的转移复发率更高。如何预防肿瘤转移复发已成为提高肝癌患者生存率的关键。因此，寻找预测肿瘤转移倾向、判断肿瘤预后的标志物，探索预防和治疗的有效途径，从而降低死亡率，提高肝癌患者的5年生存率，这是肝癌研究的重点内容，也是肿瘤防治研究中的一个难点。
　　 磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(glypican-3)是硫酸乙酰肝素糖蛋白(Heparan sulfateproteoglycan，HSPG)家族中的一员，是由蛋白质、脂质和糖三者共价连接的复杂糖复合物，广泛存在于细胞表面，通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定在细胞膜上。glypican-3又称GPC3、MXR7、OCI-5、GTXR2-2，基因片段全长大于900kb，是人类基因组中最大的基因之一。目前认为GPC3的HS链与大量生物效应分子（如生长因子及其受体、细胞外基质蛋白和粘附分子等）相互作用，从而调节细胞增殖、分化、粘附和迁移等，还可能参与抑制或调节大部分中胚层组织和器官的生长。有研究发现，GPC3参与Wnt、Hedgehog(Hh)、FGF、IGF、BMP、SMAD、TGF-β等多个与肿瘤发生发展密切相关的信号通路的调节;GPC3在肝细胞癌、大肠癌、恶性黑色素瘤、Wilm's瘤、成神经细胞瘤和肝胚细胞瘤高表达，而在肺腺癌、卵巢癌、乳腺癌、间皮瘤中表达显著下调，提示GPC3在肿瘤的发生发展中起着重要的作用，并且在不同的肿瘤中可能发挥的作用不同。据研究，GPC3在人类肝癌组织中有显著的表达，与肝癌的发生发展关系十分密切。
　　 Notch信号转导通路由一组在进化上高度保守的细胞膜配体、受体及下游分子组成。哺乳动物中存在4种Notch受体(Notch1-4)以及5种配体。Notch信号转导过程主要发生在细胞间，故Notch受体是由异二聚体组成的单跨膜分子，其配体同样为跨膜分子。目前已发现的4种Notch受体的主要区别在于EGF重复序列。Notch受体在作为受体的同时，也作为转录因子发挥巨大的作用。细胞间受体配体作用可激活Notch信号转导过程，从而直接调节基因转录，使细胞基因表达受相邻细胞调控。Notch信号在细胞分化、胚胎发育、组织自我更新过程中均发挥了重要的作用，许多病理过程（包括肿瘤）都有Notch信号参与。Notch信号多作为癌基因促进肿瘤生长，但在某些组织也可起到诱导细胞分化、抑制肿瘤增殖的作用。肿瘤干细胞中Notch信号的改变可能发挥了关键性作用。有研究观察到Notch1信号可能导致肝癌细胞周期停滞和凋亡，在肝癌中主要发挥抑癌基因的作用，与肝癌的发生发展关系密切。
　　 本课题的研究目的是通过检测GPC3及Notch1在肝癌细胞株中的表达情况，然后改变肝癌细胞中GPC3的表达水平观察Notch1表达水平的变化，最后从组织水平验证GPC3及Notch1在肝细胞癌组织中的表达情况，从而来探讨GPC3与Notch1两者在肝细胞癌中的相互关系，为深入研究肝细胞癌的分子靶向治疗靶点奠定理论基础。
　　 方法
　　 1.GPC3和Notch1在肝癌细胞株中表达情况的检测
　　 采用荧光定量RT-PCR的方法检测MHCC97-H、SMMC-7721、HepG2、QGY-7701和Bel-7402等5种肝癌细胞株中GPC3 mRNA和Notch1 mRNA的表达情况，然后用Western blotting检测这5种肝癌细胞株中GPC3和Notch1的蛋白表达水平。
　　 2.构建干扰GPC3表达的重组质粒DNA
　　 根据GPC3基因的相关信息（序列、序列号等），设计了4条shRNA序列（包括 GPC3-809-shRNA、GPC3-1246-shRNA、GPC3-1720-shRNA、GPC3-715-shRNA);然后按设计好的shRNA序列设计、合成两条互补的短片段的DNA;对合成好的DNA片段进行稀释、退火，连接到线形化处理过的pGPU6/GFP/Neo载体，转化，涂平板，过夜培养，筛选阳性菌落进行测序。
　　 3.瞬时转染MHCC97-H和SMMC-7721肝癌细胞株，观察干扰GPC3表达后Notch1表达水平的变化情况
　　 采用脂质体转染技术将构建好的质粒做转染实验，筛选出一条最有效的shRNA序列;然后用筛选出的高效重组质粒转染MHCC97-H和SMMC-7721肝癌细胞株，转染48小时后利用荧光定量RT-PCR和Western blotting方法检测GPC3和Notch1的表达情况，从而观察干扰GPC3表达后Notch1表达水平的变化。
　　 4.GPC3和Notch1在肝细胞癌组织中表达情况的鉴定
　　 应用免疫组化方法、计算机图像分析等技术检测30例肝细胞癌组织中GPC3和Notch1的表达情况。
　　 5.统计学方法
　　 应用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。计数资料用Nonparametric Test;计量资料用Compare Means中的Independent-Samples TTest和One-WayANOVA;相关性分析采用Bivariate。P＜0.05表示差异有统计学意义，检验水准为α=0.05，采用双侧性检验。
　　 结果
　　 1.GPC3和Notch1在肝癌细胞株中的表达情况
　　 荧光定量RT-PCR结果显示，在MHCC97-H、SMMC-7721、HepG2、QGY-7701和Bel-7402等5种肝癌细胞株中GPC3的表达差异具有显著性(F=112.516，P=0.000)，Notch1的表达差异也具有显著性(F=123.793，P=0.000)。运用2-△△ct法，以QGY-7701细胞为对照，结果发现在Bel-7402、QGY-7701、HepG2、SMMC-7721和MHCC97-H等5种肝癌细胞株中GPC3的表达依次升高(P＜0.05)，而Notch1的表达依次降低(P＜0.05)。
　　 Western blotting结果显示，在Bel-7402、QGY-7701、HepG2、SMMC-7721和MHCC97-H等5种肝癌细胞株中GPC3的蛋白表达水平依次升高，Notch1的蛋白表达水平依次降低。
　　 2.4条shRNA序列的筛选
　　 将按设计的4条shRNA序列构建的干扰GPC3表达的4个质粒及阴性对照质粒(NC-shRNA)转染MHCC97-H细胞，转染48h后在荧光显微镜下观察，计算转染效率:GPC3-809-shRNA组为82.5％，GPC3-1246-shRNA组为55.7％，GPC3-1720-shRNA组为47.3％，GPC3-715-shRNA组为76.2％，NC-shRNA组为79.6％。对于以上5组转染后的MHCC97-H细胞，荧光定量RT-PCR结果显示，GPC3的表达差异具有显著性(F=63.871，P=0.000)，其中GPC3-809-shRNA组的GPC3表达水平最低(P＜0.05); Western blotting结果也显示GPC3-809-shRNA组的GPC3表达水平最低。综上得出，GPC3-809-shRNA组的转染效率最高，干扰效率也最高。
　　 3.干扰GPC3表达后Notch1表达水平的变化
　　 用GPC3-809-shRNA组和NC-shRNA组质粒分别转染MHCC97-H、SMMC-7721肝癌细胞，转染48h后，荧光定量RT-PCR结果显示，GPC3-809-shRNA组MHCC97-H细胞的GPC3表达水平为NC-shRNA组MHCC97-H细胞的0.281±0.081（t=6.221，P=0.003）;GPC3-809-shRNA组MHCC97-H细胞的Notch1表达水平为NC-shRNA组MHCC97-H细胞的5.243±0.308(t=13.636，P=0.000); GPC3-809-shRNA组SMMC-7721细胞的GPC3表达水平为NC-shRNA组SMMC-7721细胞的0.427±0.110(t=5.645，P=0.005);GPC3-809-shRNA组SMMC-7721细胞的Notch1表达水平为NC-shRNA组SMMC-7721细胞的3.782±0.200(t=10.605，P=0.008)。Western blotting结果显示，对于转染后的MHCC97-H和SMMC-7721细胞，GPC3-809-shRNA组的GPC3蛋白表达水平均低于NC-shRNA组，而GPC3-809-shRNA组的Notch1蛋白表达水平均高于NC-shRNA组。
　　 4.GPC3和Notch1在肝细胞癌组织中的表达情况
　　 免疫组化的半定量和定量描述结果均显示，在高分化、中分化和低分化的肝细胞癌组织中，GPC3的表达水平依次升高，差异有显著性(P＜0.05)或高度显著性(P＜0.01); Notch1的表达水平依次降低，差异有显著性(P＜0.05)或高度显著性(P＜0.01)。半定量描述结果的Spearman法等级相关分析表明，GPC3与Notch1之间的表达呈高度显著性负相关(rp=-0.607，P=0.000);定量描述结果的Pearson法相关分析也表明，GPC3与Notch1之间的表达呈高度显著性负相关(r=-0.692，P=0.000)。
　　 结论
　　 1.在Bel-7402、QGY-7701、HepG2、SMMC-7721和MHCC97-H等5种肝癌细胞株中GPC3的表达水平依次升高，Notch1的表达水平依次降低，GPC3与Notch1在这5种肝癌细胞株中的表达水平相反。
　　 2.应用RNAi技术，将靶向GPC3基因的shRNA转染肝癌细胞，能成功介导GPC3基因沉默，达到靶向封闭GPC3基因的目的。在设计的4个shRNA序列中，以GPC3-809-shRNA序列的转染效率最高，靶向GPC3的干扰效率最高。实验结果显示，沉默GPC3基因的表达后，Notch1基因的表达水平发生了变化，其表达水平上调。提示GPC3与Notch1之间可能存在负性的相互调节机制。
　　 3.肝细胞癌组织分化程度越高，GPC3的表达越低，Notch1的表达越高;分化程度越低，GPC3的表达越高，Notch1的表达越低。GPC3与Notch1在肝细胞癌组织中的表达水平呈现显著性负相关，从组织水平验证了GPC3与Notch1之间的相互关系。

目录

摘要

前言

技术路线

第一章 肝癌细胞中GPC3与Notch1的表达情况

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

参考文献

第二章 GPC3基因沉默对肝癌细胞中Notch1表达水平的影响

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

参考文献

第三章 肝细胞癌组织中GPC3和Notch1的表达情况

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

参考文献

全文小结

硕士期间发表论文

致谢

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