维生素对类风湿关节炎大鼠血清瘦素和其他细胞因子的影响及作用机制

摘要

研究背景及目的:
　　 类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一种自身免疫性疾病，以非化脓性增生性滑膜炎为特点，逐渐导致关节软骨的破坏，最后造成关节功能的障碍。RA是全世界范围内倍受关注的公共卫生问题，流行病学调查显示我国患病率约为0.32～0.36％，欧洲成年人RA患病率为0.2％～0.8％，其中南欧地区(意大利、希腊）患病率较低，为0.2％～0.4％，患病率随着年龄的增长而逐渐增加，研究显示老年人(65岁以上或70岁以上)患病率最高，其中女性高于男性。RA发病机制复杂，涉及遗传、营养、感染等多个因素。大量研究表明，细胞因子的异常产生和相互作用在形成RA炎症、黏附、新生血管形成和骨质减少方而起着重要的作用。细胞因子是活化的免疫细胞和某些基质细胞分泌的具有生物活性的小分子多肽物质的总称，它包括淋巴细胞产生的淋巴因子和单核巨噬细胞产生的单核因子，作为细胞间信号转导分子，主要调节免疫应答、参与免疫细胞分化发育、介导炎症反应、刺激造血功能并参与组织修复等。RA的启动是通过递呈至今未明的抗原或自身抗原给CD4+淋巴细胞，两者相互作用激活了淋巴细胞，而活化的淋巴细胞可以刺激单核/巨噬细胞释放细胞因子，这些细胞因子能介导RA炎症反应和关节损伤。RA中存在复杂的细胞因子网络，网络的生物学效应则依靠于细胞因子及其抑制物的相对浓度。
　　 瘦素(leptin)主要是由白色脂肪组织分泌的一种非糖基化蛋白类激素，分子量为16000，传统观点认为leptin主要与脂肪储存、能量摄入以及机体对食物的摄入有关。越来越多的证据显示瘦素是机体营养状况和免疫系统之间相互影响、相互联系的重要中介，与自身免疫性疾病有密切关系，可作为炎症介质网络中的一种细胞因子发挥作用。leptin主要通过JAK/STAT信号通路在调节细胞增殖、分化、免疫调节、炎症等多种过程中发挥重要作用，瘦素受体属于Ⅰ类细胞因子超家族，包括细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。作为JAK家族的成员，胞质酪氨酸激酶结合于瘦素受体上，其识别位点分布于受体特异的膜近端区域，STATs与细胞膜上的瘦素受体特异性结合，酪氨酸被JAKs磷酸化后，STATs与受体解离，形成同型或异型二聚体，进入细胞核内调节特异的基因转录和蛋白合成。由于该通路中的STATs是一组多效能蛋白质，在不同条件下可表现出不同的生物学功效。在RA中，参与信号转导的主要是STAT1和STAT3。
　　 红细胞沉降率(Erythrocyte sedimentation rate，ESR)、C反应蛋白(C-reactiveprotein，CRP)、类风湿因子(Rheumatoid arthritis，RF)是RA常用的辅助诊断项目。ESR增快表明机体处于病理状态，广泛用于监测感染、炎症及一些癌症患者的疾病活动程度;CRP是一种急性时相反应蛋白，很多急性和慢性炎性反应时CRP均表现为增高;RF是目前最常用的血清学检测项目，RF的敏感性虽高，特异性却不高，在RA以外的其他疾病如系统性红斑狼疮、原发性干燥综合征、恶性肿瘤甚至一些正常的老年人也可出现升高，经常容易造成误诊和漏诊，给早期诊断带来困难，从而延误病情，错过治疗时机，因此RF阳性不能作为诊断RA唯一标准。近年的研究表明，RF与临床表现和关节损伤程度密切相关，是损伤指标中最强有力的预后因子之一，但不是RA的高特异性血清标志物，其他指标如CRP、ESR等也不能取代RF在RA诊断和预后判断中的地位。
　　 对RA的治疗目前尚缺乏特效手段，主要采用改善病情的抗风湿药物、非甾体类抗炎药、生物制剂等，由于用药周期长加上药物的一些副反应，病人依从性较差。一项调查显示有20％～50％的患者希望通过膳食减轻RA症状，约有2/3的RA患者使用过膳食补充剂。尽管RA的病因尚不明确，大量研究表明，富含鱼类、橄榄油、蔬菜的饮食能抑制RA病情的发展，而富含红肉等的食物能加重病情。研究表明，具有抗氧化功能的维生素可能对RA具有治疗作用，VitA、VitE具有抗氧化、免疫调节、抗肿瘤等多种生物功能。体外实验显示VitA、VitE具有抑制某些炎症因子的作用。
　　 本研究拟通过建立类风湿关节炎大鼠模型，观察瘦素在RA发病过程中所起的作用;灌胃给予类风湿关节炎大鼠VitA、VitE，取血清及滑膜组织，观察VitA、VitE对类风湿关节炎大鼠血清细胞因子如瘦素、TNF-α、IL-6、IL-4、IL-10水平的影响，同时观察其对疾病活动指标ESR、CRP、RF的影响。采用Western blot研究VitA、VitE对CIA大鼠关节滑膜组织STAT1、STAT3蛋白表达水平的影响，从分子水平探讨VitA、VitE在RA中所起的作用。
　　 材料与方法:
　　 选体重为（147±15g）的健康雄性Wistar大鼠作为研究对象，饲养于恒温，恒湿条件下并自由摄取食水，饲养一周左右开始实验。随机分为正常组和模型组。将牛Ⅱ型胶原与弗氏不完全佐剂用三通管在低温条件(＜3℃)下按1∶1的比例充分乳化（约1h），形成乳白色粘稠样液体备用。用5％水合氯醛5ml/kg常规腹腔麻醉，将配置好的试剂按3点/只，0.05ml/点皮内注射进行初次免疫，以皮肤出现白色丘疹样隆起为度。初次免疫动物2周后，加强免疫一次，剂量:2点/只，0.05ml/点，空白对照组用生理盐水0.2ml腹腔注射。初次免疫第一天起，每天观察大鼠的生长情况，重点观察四肢足关节肿胀情况，并按0～4级进行评分，四肢评分之和为关节炎指数(Arthritis index，AI)，AI越高，表明关节炎程度越严重。0分，无关节炎;1分，关节表面有红色斑点或关节部位轻度肿胀;2分，关节部位中度肿胀;3分，关节部位严重肿胀;4分，关节部位严重肿胀，且不能负重。四周后将模型制作组中AI≥6的大鼠保留。
　　 模型组大鼠于第4周末随机分为4组，即模型组;模型组+VitA42.86μgRE/kg.bw;模型组+VitE200mg/kg.bw;模型组+布洛芬50mg/kg.bw。药物均为灌胃给药，正常对照组予等体积生理盐水腹腔注射，每日一次，持续4周。4周后，小鼠禁食24h，6％水合氯醛麻醉后，腹主动脉取血处死，分离血清，置-20℃保存。打开膝关节腔，完整剥离滑膜组织。用ELISA法按试剂盒操作，检测血清瘦素、TNF-α、IL-6、IL-4、IL-10水平，以Western blot印迹分析STAT1、STAT3蛋白表达水平。
　　 结果:
　　 1.CIA大鼠模型的建立
　　 牛Ⅱ型胶原与弗氏不完全佐剂建立CIA大鼠模型，以关节炎指数为评分标准，AI≥6的大鼠保留。模型组与空白对照组同期比较，主要表现为关节红肿，累及踝关节、趾间关节及膝关节，此可以得出结论，CIA大鼠模型建立成功。
　　 2.CIA大鼠血清leptin、TNF-α、IL-6、IL-4、IL-10及ESR、CRP、RF的水平。
　　 模型组大鼠血清leptin、TNF-α、IL-6水平明显高于对照组(P=0.000); IL-4、IL-10水平低于对照组，差异有显著性(P=0.000，0.001);模型组大鼠血清ESR、CRP、RF高于对照组，差异有显著性(P=0.000）;
　　 3.VitA、ViE对CIA大鼠关节炎指数、细胞因子、疾病活动指标的影响。
　　 与模型组相比，VitA组与VitE组关节炎指数降低，差异有显著性(P=0.008，0.014);与模型组相比，VitA组leptin、TNF-α、IL-6水平降低，差异有显著性（P=0.000，0.038，0.000），VitE组leptin、TNF-α、IL-6水平亦降低，差异有显著性(P=0.004，0.033，0.000); VitA、VitE组与模型组比，IL-10含量升高，差异有显著性（P=0.006，0.001）。VitA组与模犁组比，ESR、CRP含量明显降低，差异有显著性（P=0.025，0.001），VitE组与模型组比， ESR、CRP含量亦明显降低，差异有显著性(P=0.001，0.017)
　　 4.VitA、VitE对CIA大鼠关节滑膜组织p-STAT1、p-STAT3表达水平的影响
　　 与对照组相比，模型组p-STAT1、p-STAT3蛋白表达水平升高，差异有显著性(P=0.000)。VitA、VitE给药4周后，p-STAT3蛋白表达水平较模型组降低，差异有显著性(P=0.000）。
　　 结论:
　　 1.应用牛Ⅱ型胶原加弗氏不完全佐剂建立方法可以成功制作大鼠RA模型，该模型是国内外最常用的RA动物模型。
　　 2.在RA发病过程中存在一个失衡的细胞因子网络，促炎性细胞因子相对增多，抑炎性细胞因子相对减少，leptin参与了RA的发病过程，可作为一种促炎性细胞因子发挥作用。
　　 3.VitA、VitE能抑制促炎性细胞因子leptin、TNF-α、IL-6的水平，同时提高抑炎性细胞因子IL-10的水平。能降低CIA大鼠的关节炎指数、降低ESR和CRP。VitA、VitE通过下调关节滑膜组织中STAT3蛋白的表达水平阻断JAK/STAT信号转导通路，这就为RA的治疗开辟了一条新的途径。

目录

摘要

第一章 胶原诱导性关节炎大鼠模型的建立

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二章 瘦素在CIA大鼠血清中的水平及在发病机制中的作用

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

维生素对类风湿关节炎大鼠血清瘦素的影响及机制的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述 瘦素与类风湿关节炎关系的研究进展

主要英文缩写词表

致谢

声明

统计学审稿证明