晚期糖基化终产物受体通过AKT通路作用于视网膜母细胞瘤蛋白对前列腺癌增殖的影响及机制研究

摘要

背景：前列腺癌是男性泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤之一，在癌症的分类上，前列腺癌是全球第六大癌症，又是全球男性第二大癌症。同时其发病率增长速度也明显增快，由2001年的第8位上升到了2010年的第6位。欧美国家发病率在100/10万以上，美国年发病13万例。虽然欧美国家发病率显著高于我国，但一些大城市的流行病学调查表明，目前前列腺癌的发病率已经直追欧美国家。前列腺癌发病率在我国显著增长可能跟人口的老龄化、饮食结构的改变、生活环境的污染以及检测技术的发展息息相关。随着前列腺癌发病率的显著增长，对前列腺癌的研究也越来越多。目前对前列腺癌发病机制研究的主要方面在细胞调节信号通路和雄激素受体的突变、基因扩增上。其中研究的热点主要集中在对前列腺癌的发病机制中信号传导通路的研究，因为它是从分子水平层面上得到更多疾病的发生与发展的信息，为彻底治疗疾病提供良好的依据。某些研究表明，原癌基因ras、Fos、c-myc、c-met、Bcl-2等的激活和表达上调，抑癌基因Rb、p53、p16、PTEN、CDKN2等的失活、蛋白AR（androgen receptor，雄激素受体）、前列腺干细胞抗原(prostate stem cellantigen，PSCA)等的异常表达以及启动子甲基化及DNA损伤应答通路异常可能参与前列腺癌发生发展的过程中。而最近研究发现，晚期糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation end products，RAGE)与前列腺癌也密切相关。晚期糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation end products，RAGE)是晚期糖基化终产物（advanced end products，AGE）的受体，其编码基因位于Ⅲ类主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex，MHCⅢ)区域。RAGE最早在1992年报导，且在过去的20年里，它被认为在糖尿病、败血症、炎症和肿瘤发展中有重要作用。现有研究已经证实，RAGE作为信号通路的一个转导受体和其配体在单核巨噬细胞、血管内皮细胞、神经细胞、血管平滑肌细胞及多种肿瘤细胞表面结合，从而激活内部各种信号转导机制，发生病理效应。RAGE在肿瘤的作用是近十多年才发现的，目前的研究表明，RAGE在除肺癌之外的许多肿瘤表达上调，并且与肿瘤的发生、发展和不良预后密切关联。我们前期的研究表明，RAGE可能与视网膜母细胞瘤(RetinoblastomaProtein，Rb)蛋白相互作用促进前列腺癌的增殖。Rb基因是人类最早发现的一种抑癌基因，基因产物是110 kd的具有DNA结合能力的核磷蛋白质，参与细胞周期的调节对细胞生长起负调控作用。未磷酸化的Rb蛋白起抗癌作用，而磷酸化的Rb蛋白则没有这个作用。Rb蛋白和转录因子E2F结合并抑制其活性，使细胞停滞在G1期，从而抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，而Rb蛋白被磷酸化时，就会从转录因子E2F解离下来，导致促使DNA合成相关的酶的转录启动，使细胞从G1期进入S期，引起细胞增殖。前列腺癌中大多数Rb等位基因丢失而导致Rb蛋白作用丧失。同时在60％前列腺癌临床病例可观察到Rb杂合子的丢失。Maddison的研究表明，Rb的失活引起E2F表达增多，促进前列腺癌的发生发展和转移。Taneja SS等研究表明在泛素-蛋白酶体系统降解Rb蛋白的过程中，可能有雄激素的参与，且其降解过程可为cyclin A/Cdk2和cyclin B/Cdk1诱导的Rb磷酸化所加速，从而促进了LNCaP细胞的生长。也有研究表明Rb蛋白能够与雄激素受体蛋白特异性结合增强雄激素受体的转录活性，从而促进前列腺癌的发生发展。在我们前期的工作中，我们证实AGE与RAGE间相互作用能促进前列腺癌细胞的增殖，且这种作用可能跟RB蛋白的表达有关，但是具体的作用方式尚未清楚。Ning等人的研究证明，跟细胞周期调控有关的某些蛋白如RB可能受AKT信号通路调控，我们推测RB蛋白的变化可能是通过AKT通路引起的。Akt是存在于人类染色体中的病毒原癌基因v-Akt的同源物，本质也是一种原癌基因;其编码的蛋白质产物PKB是分子量约为57 kd的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，为PI3K/Akt信号转导通路中的核心蛋白。Akt家族的成员有Aktl/PKBa，Akt2/PKBp，Akt3/PKB7三种亚型，分别定位于14q32.32，19q13.1-q13.2，lq44。Akt三个亚型均能活化下游底物，其中又以Akt2的作用最明显。Sale[47]利用亚型特异的反义寡核苷酸探针策略对Akt及其三个亚型的功能进行研究，Akt的三个亚型不但有80％以上的同源性的氨基酸序列，而且均有共同结构特征。其共同结构特征包括三个不同的功能区域，分别为氨基末端的PH区域、中央区的重要激酶区以及羧基末端的调节区。这三个功能区在PI3K/Akt信号转导通路中分别担当着重要的作用。PH区域由约100个氨基酸序列和3-磷酸肌醇结合区域组成，主要调节蛋白质-脂质和蛋白质-蛋白质的相互作用;中央区的重要激酶区与PKA、PKC有高度的相似性，Akt部分活化所必需的Thr-308位于该区域;羧基末端的调节区由40个氨基酸系列组成，其中包含有蛋白激酶的一个特征性疏水基序F-X-X-F/Y-S/T-Y/F(X是任意氨基酸)，Akt完全活化所必需的丝/苏氨酸残基的磷酸化也位于这个区域。研究表明，Akt的活化参与肿瘤的发生发展。可能的主要机制是由于基因PIK3CA编码的PI3K蛋白的扩增和其他各种因素导致的Akt的过度活化，或者是缺失了某些调控成分的功能，如PTEN。在前列腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、滤泡状甲状腺癌、多发性骨髓瘤、恶性黑色素瘤中都存在Akt的过度表达，而约50％～80％进展期前列腺癌患者中存在PTEN功能的缺失，从而导致了第二信使(PIP3)的过量表达，引起Akt蛋白的过度激活，增强前列腺癌细胞的存活。Gao等证实了在前列腺癌患者中Aktl通过干扰APC/Cdhl与Skp2结合从而促进肿瘤的进展。在肿瘤的发生发展过程中，Akt除了促进细胞生长、增殖外，还抑制细胞凋亡。Akt通过多种途径抑制细胞凋亡。同时AKT跟凋亡有关的多个家族和蛋白之间存在相互作用，如Bcl-2家族、Foxo家族、IAPs(inhibitor of apop-tosis proteins)和caspase-9。总之，细胞存活通路PI3K/Akt中的重要分子-AKT，在促进细胞生长和增殖、侵袭和浸润，以及抑制细胞凋亡中起着核心的作用。我们已经初步证明了RAGE与Rb蛋白在前列腺癌中存在某种关系，但两者之间的这种相互作用是直接的还是间接的，它们发生联系是依靠何种方式，有什么信号通路参与其中，且这种相互作用对前列腺的发生发展有何意义？当弄清楚这些问题的答案时，我们不但能够更清楚理解RAGE及Rb蛋白的功能，而且将对前列腺癌乃至其它相关疾病的发生发展及预防诊治提供新的思路和理论依据。
　　 方法：基于以上认识，本研究首先进行用Western Blotting检测前列腺癌细胞系PC-3细胞中的胞质和胞核中RAGE的表达，以明确RAGE的定位，同时推测RAGE与RB蛋白的作用方式;接着我们用AGEs对前列腺癌进行不同时间段和不同浓度刺激，以观察前列腺癌细胞中Rb蛋白及RB蛋白磷酸化Ser-807/811位点的表达情况。然后我们检测同一条件下，AKT蛋白及AKT蛋白磷酸化Ser473、Thr308位点的表达情况。我们在PC-3细胞中转染了干扰RB蛋白的RNA小片段，以寻求一种阻断RB蛋白表达的方法。最后我们构建缺失RAGE胞外段不同功能段V/VC1的真核表达载体，以确定RAGE与Rb蛋白两者间相互作用的条件。
　　 结果：⑴证实RAGE主要在前列腺癌细胞的细胞浆中分布;⑵初步证实AGEs刺激PC-3细胞能导致RB蛋白的表达下调及磷酸化增强，Rb蛋白的表达下调及磷酸化增强可能通过是RAGE与AGEs作用所激活的AKT信号通路所介导的;⑶初步证实AGEs刺激PC-3细胞能导致AKT蛋白的磷酸化增强，AKT蛋白磷酸化增强是可能通过RAGE与AGEs作用所激活的;⑷成功干扰了前列腺癌中RB蛋白的表达;⑸成功地构建了缺失RAGE胞外段不同功能段V/VC1的真核表达载体，其能够在PC-3细胞中表达。
　　 结论：本研究对RAGE与Rb蛋白的相互作用方式进行了初步研究。AGEs与前列腺癌细胞的RAGE受体结合，导致AKT蛋白的活化及磷酸化增强，AKT通路被激活，从而导致Rb蛋白的下调及磷酸化增强，促进前列腺癌的增殖。这些研究结果不但加深了我们对RAGE与Rb蛋白生物学功能的认识，而且还有可能从根本上影响和改变临床上对前列腺癌的认识和治疗方案，因此具有极为重要的基础理论和临床治疗意义。

目录

摘要

前言

材料

1 主要仪器

2 主要实验试剂及耗材

3 试剂配制

4 质粒、菌株和细胞株

方法

1 细胞培养

2 BCA法蛋白定量

3 核质分离检测RAGE亚细胞定位

4 AGE-BSA刺激下前列腺癌细胞Rb蛋白及磷酸化位点Ser807／811表达情况表达情况

5 AGE-BSA刺激下前列腺癌细胞中总AKT蛋白和AKT磷酸化位点色氨酸473、苏氨酸308位表达情况

6 晚期糖基化终末产物受体胞外段不同功能段真核表达载体的构建及其在前列腺癌细胞中的表达与定位

7 siRNA干扰PC-3细胞中RB蛋白的表达

结果

1 RAGE在前列腺癌细胞中的亚细胞定位

2 AGE-BSA刺激条件下前列腺癌细胞PC-3细胞中RB的表达

3 AGE-BSA刺激下前列腺癌细胞中Rb蛋白磷酸化位点Ser807／811表达

4 AGE-BSA刺激下前列腺癌细胞中总AKT蛋白和AKT磷酸化位点色氨酸473、苏氨酸308位表达

5 晚期糖基化终产物受体胞外段缺失体delta-V／delta-VC1真核表达载体的构建及其在前列腺癌细胞中的表达与定位

6 siRNA干扰PC-3细胞中RB蛋白的表达

讨论

1 RAGE与前列腺癌

2 Rb蛋白在前列腺癌中的改变

3 AKT蛋白在前列腺癌中的改变

4 AGEs-RAGE通过AKT通路与RB蛋白在前列腺癌发挥作用

小结

参考文献

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