晚期糖基化终产物受体与视网膜母细胞瘤蛋白的相互作用对前列腺癌增殖的影响及机制研究

摘要

背景:
　　 在全球范围内，前列腺癌的发病率居所有恶性肿瘤的第5位和男性恶性肿瘤的第2位。在美国，前列腺癌发病率在男性恶性肿瘤中已高居第一位，而死亡率则仅次于肺癌，居第二位。目前我国的前列腺癌发生率约为美国的1/10;但随着生活方式的西方化、人口的老龄化及前列腺癌肿瘤标志物如前列腺特异性抗原(prostate specific antigen，PSA)、前列腺干细胞抗原(prostate stemcell antigen，PSCA)、前列腺特异性膜抗原(prostate specific membrane antigen，PSMA)、DD3基因、人类腺体激肽释放酶-2(human kallikreins-2，hK2)、α-甲基-辅酶A消旋酶(Alpha-methylacyl-CoA racemase，AMACR)及尿激酶型纤溶酶原激活物系统等早期筛查技术的应用，前列腺癌的发病率和诊断率呈上升趋势。
　　 随着对前列腺癌研究的深入，多种与前列腺癌有关的基因及蛋白以及它们的作用机制受到关注，如:p53、p16、PTEN、NKX3.1、Rb、LKB1等抑癌基因的失活或缺失，C-MYC、met、ras等癌基因的异常表达，TMPRSS2:ERG等融合基因的异常表达，AR(androgen receptor，雄激素受体)、前列腺干细胞抗原(prostate stem cell antigen，PSCA)等蛋白异常表达、启动子甲基化及DNA损伤应答通路异常。但是，前列腺癌的发病机制及其发生发展的分子生物学基础仍不清楚。而最近研究发现，晚期糖基化终产物受体( receptor foradvanced glycation end products，RAGE)与前列腺癌也密切相关。
　　 虽然RAGE最初是作为晚期糖基化终产物(advanced glycation endproducts，AGEs)受体被发现并因此得名，但其配体并不止一个，而是一个配体家族，除AGEs之外，还包括双性素(amphoterin)、β-淀粉样多肽(amyloid-β peptide)、钙结合蛋白家族(S100蛋白家族)、免疫球蛋白轻链以及朊病毒等，RAGE与各配体间的相互作用在肿瘤的发生发展及转移中起着重要的作用;阻断RAGE与其配体间的相互作用，能够抑制肿瘤的生长和转移。而RAGE与前列腺癌的作用关系是最近才被发现的。研究对前列腺癌标本进行分析，发现癌组织中RAGE表达水平较正常组织较高，且在癌变程度较高或者已发生远处转移的标本中尤为明显;RAGE与amphoterin、AGEs、S100A8、S100A9间相互作用对前列腺癌的发生、发展起着重要作用。除此之外，在雄激素阻断过程中，RAGE-amphoterin系统通过旁分泌途径促进肿瘤细胞与间质细胞的相互作用，从而加速前列腺的发展和转移。Allmen等进一步研究证明RAGE胞外段的Ⅴ区在整个RAGE蛋白中起主导调节作用，其与AGEs作用是介导前列腺癌生长所必须的。利用RNAi技术沉默RAGE的蛋白表达可介导前列腺癌细胞的凋亡，从而抑制前列腺癌细胞的增殖。
　　 然而，RAGE受到amphoterin、AGEs、S100A8、S100A9等各配体刺激后如何将细胞外信号转化为细胞内信号分子，细胞内信号分子又通过什么样的方式促进细胞的增殖等，这些问题至今尚未阐明。以往的工作中，我们已经成功构建了人RAGE胞内段的原核表达载体，并进行了人RAGE胞内段融合蛋白的表达与纯化，并利用T7噬菌体展示系统，初步筛选得到了25种与其有结合关系的蛋白或多肽。进而我们用ELISA法对这些蛋白或多肽进一步验证，并以BLAST软件在GenBank中对所得到的序列进行搜索和同源性分析，最终得到了9个为已知蛋白，其中一个便为视网膜母细胞瘤蛋白。
　　 Rb蛋白能够抑制前列腺癌细胞的生长与增殖。Tyagi A等以水飞蓟素(silibinin)刺激雄激素依赖型前列腺癌细胞LNCaP，下调CDK蛋白家族作用于Rb蛋白的丝氨酸位点从而抑制Rb蛋白磷酸化，从而促进了Rb蛋白与E2F蛋白结合，因此抑制前列腺癌的增殖。Rb蛋白还能特异性地与SV-40大T抗原，E1A和E7结合并起到抑制肿瘤活性的作用。但是在包括前列腺癌在内的多种肿瘤中，Rb蛋白的生物学功能常受到干扰或者丧失;而在前列腺癌中，大多数是由于Rb等位基因丢失导致Rb蛋白作用的丧失。Bookstein等研究发现前列腺癌细胞DU145的突变Rb蛋白丢失外显子21编码的35个氨基酸，但将Rb基因导入前列腺癌细胞DU145，随着正常Rb蛋白的表达前列腺癌细胞在裸鼠体内的致瘤性受到了明显的抑制，尽管DU145细胞的形态、生长速度均无变化。除此之外，Taneja SS等研究表明在雄激素作用下，泛素-蛋白酶体系统参与Rb蛋白的降解，而由cyclin A/Cdk2和cyclin B/Cdk1诱导的Rb磷酸化又加速了其降解过程，从而促进了LNCaP细胞的生长。也有研究表明Rb蛋白能够与雄激素受体蛋白特异性结合，该结合可以诱导雄激素受体的转录活性，从而促进前列腺癌的发生发展。
　　 我们已经初步证明了RAGE与Rb蛋白存在结合关系，但两者确切的相互作用关系还需要进一步的体内免疫共沉淀实验加以验证，并且两者相互作用的结构域是什么？Rb本身是一种核蛋白，它在与RAGE相互作用过程对前列腺癌又有怎样的生物学意义？对这些问题的回答，不仅能够阐明RAGE及Rb蛋白功能，而且将对前列腺癌乃至其它相关疾病的发生发展及预防诊治提供新的思路和理论依据。
　　 方法:
　　 基于以上认识，本研究主要进行了以下实验:
　　 1、Western Blotting检测3种前列腺癌细胞系中RAGE与Rb蛋白的表达，以选择合适研究对象;
　　 2、利用CCK-8检测AGEs刺激下前列腺癌细胞的增殖情况;
　　 3、通过免疫共沉淀实验和免疫荧光实验，进一步确定RAGE与Rb蛋白在前列腺癌细胞中的相互作用;
　　 4、通过AGEs对前列腺癌进行不同时间段和不同浓度刺激，观察前列腺癌细胞中Rb蛋白的表达情况;
　　 5、最后我们构建RAGE胞外段不同功能段真核表达载体，进而观察RAGE与Rb蛋白两者间相互作用的结果域。
　　 结果:
　　 1、验证RAGE蛋白在前列腺癌细胞系LNCaP、DU145、PC-3的表达，但只有在LNCaP、PC-3细胞中能检测到Rb蛋白表达，DU145细胞中未检测到Rb蛋白的表达;
　　 2、在前列腺癌LNCaP、PC-3细胞中AGE-BSA刺激组与BSA刺激组、空白对照组存在统计学差异(P＜0.05)，BSA刺激组和空白对照组之间没有统计学差异(P＞0.1)，说明AGE-BSA可能通过RAGE促进前列腺癌细胞的增殖;
　　 3、RAGE在前列腺癌LNCaP、PC-3细胞的细胞浆和细胞核中均有分布，内源性RAGE与Rb蛋白在两种前列腺癌细胞内均存在共定位，这表明两者间存在相互作用的可能;
　　 4、用RAGE抗体进行免疫共沉淀，沉淀下来的复合物存在Rb蛋白;用Rb抗体进行免疫共沉淀，沉淀下来的复合物存在RAGE。说明在前列腺癌LNCaP、PC-3细胞中内源性RAGE与Rb蛋白存在相互作用;
　　 5、给予400ng/ml及800ng/ml AGE-BSA刺激48h后，LNCaP细胞和PC-3细胞中Rb蛋白的表达明显下调，表达量随刺激浓度的增加而减少，而BSA对照组则没有出现表达下调现象;在不同时间点内给予400ng/ml AGE-BSA刺激LNCaP细胞和PC-3细胞，Rb蛋白的表达量随刺激时间的延长而减少，刺激72h后，Rb蛋白的表达明显下调;
　　 6、成功构建pcDNA3-HA-RAGEV和pcDNA3-HA-RAGEVC(1)重组质粒;
　　 7、转染后的质粒能在PC-3细胞中高效表达，且过表达的蛋白主要定位于细胞浆中。
　　 结论:
　　 通过以上研究，我们得到了以下结论:
　　 1、初步证实AGE与RAGE间相互作用能促进前列腺癌细胞的增殖;
　　 2、证实RAGE在前列腺癌细胞的细胞浆和细胞核中均有分布，内源性RAGE与Rb蛋白在两种前列腺癌细胞内均存在共定位;
　　 3、证实在前列腺癌细胞中内源性RAGE与Rb蛋白存在相互作用;
　　 4、初步证实AGEs刺激前列腺癌细胞能导致Rb蛋白的表达下调，Rb蛋白的表达下调可能通过与RAGE间的相互作用而介导的。
　　 5、成功地构建了RAGE不同功能段V/VC(1)真核表达载体，其能够在前列腺癌细胞中表达。

目录

摘要

前言

材料

1．主要仪器

2．主要实验试剂及耗材

3．试剂配制

4．质粒、菌株和细胞株

方法

1．细胞培养

2．Bradford法蛋白定量

3．Western blot检测前列腺癌细胞中内源性RAGE及Rb蛋白的表达情况

4．cck-8法检测AGE-BSA刺激下前列腺癌细胞的增殖情况

5．RAGE与Rb蛋白在前列腺癌中的相互作用

6．AGE-BSA刺激下前列腺癌细胞中Rb蛋白表达情况

7．晚期糖基化终末产物受体胞外段不同功能段真核表达载体的构建及其在前列腺癌细胞中的表达与定位

8．统计学处理

结果

1．不同前列腺癌细胞系中内源性RAGE及Rb蛋白的表达情况

2．RAGE与前列腺癌细胞增殖关系

3．RAGE与Rb蛋白在前列腺癌中的定位及相互作用

4．AGEs刺激下前列腺癌细胞中Rb蛋白的表达

5．晚期糖基化终末产物受体胞外段不同功能段真核表达载体的构建及其在前列腺癌细胞中的表达与定位

讨论

1．RAGE与前列腺癌

2．Rb蛋白与前列腺癌

3．RAGE与RB蛋白在前列腺癌的作用

小结

参考文献

研究生期间发表的论文

致谢

声明

统计学证明