高同型半胱氨酸对HDl-C正常患者的冠脉病变和HDL功能的影响

摘要

一研究背景：
　　 随着人民生活水平的提高以及人口老龄化进展的加快，近20年来我国心脑血管疾病发病率与死亡率逐年升高。冠心病(CAD)是由冠状动脉粥样硬化引起的心肌缺血性疾病，动脉粥样硬化(AS)是CAD的病理基础，脂质浸润学说贯穿了AS的形成、进展及恶化，并与其他学说密切相关，血脂异常是AS发生和发展的最重要因素之一。大量流行病学资料显示，AS的严重程度随血清胆固醇水平的升高呈正相关，血清胆固醇的浓度与冠心病的死亡率呈正相关。低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)升高导致的血脂异常是AS病理改变基础之一，AS的严重程度与LDL-C水平的升高呈线性加重，LDL-C水平与各种心脑血管事件的发生率呈正相关。临床治疗上，我们采用他汀类等药物降低LDL-C水平，可显著减少心脑血管疾病的发生，降低LDL-C能让病人在临床治疗中获益。但是，尽管LDL-C水平达到指南要求甚至低于指南要求，但患者心脑血管事件发生率也只能降低30％左右，依然残留70％左右心血管事件发生率无法避免。
　　 高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)是另外一种重要的脂蛋白，HDL具有心血管保护作用，大量流行病学资料表明，血清HDL-C浓度与CAD发病危险呈独立的负相关;Framingham研究发现，血清HDL-C＜35mg/dl者的CAD死亡率为血清HDL＞55 mg/dl者的4.1倍;血清HDL-C水平每升高1mg/dl，男性患者CAD的危险性即降低2％，女性降低3％。以上结果均提示，HDL是AS的保护因素之一，升高HDL-C水平是抗AS的靶点之一。HDL通过多种机制发挥抗AS的功效，包括对逆胆固醇转运(Reverse Cholesterol Transport，RCT)、抗氧化、抗炎、改善内皮细胞功能失调、抗血栓及促纤溶等。
　　 然而，越来越多的研究发现升高HDL-C水平并未达到人们预期的效果，CETP抑制剂torcetrapib尽管大幅度升高HDL-C水平，但torcetrapib组的全因死亡人数较阿托伐他汀组多，该研究不得不提前终止。Gomarasch等发现在载脂蛋白AI(ApoA-I)转变为ApoA-I Milano人群中，HDL-C的水平低，但其CAD的发生率也低且明显长寿。肝脏清道夫受体BI(SR-BI)高度表达小鼠，虽然降低了HDL-C水平，却具有显著的抗AS功能。因此HDL-C与AS的关系比我们想像中更加复杂，我们临床工作者及科研人员应重新审视HDL-C水平的意义，不单单需要关注HDL-C的水平，更需要关注HDL的功能对AS的影响。
　　 正常HDL功能的HDL才能发挥抗AS作用，而功能异常的HDL甚至有促AS进展的作用。HDL的多面性，与其结构复杂密切相关，HDL包含着多种酶和脂蛋白，其代谢途径也受多种酶的影响，其中任何一个脂蛋白性质的改变、酶的活性或者量的改变均能影响HDL的正常功能。RCT是HDL抗AS的重要的功能之一，RCT是一个复杂的过程，外周组织（包括动脉壁）游离胆固醇在多种酶的作用下与血清中ApoA-I结合后逐渐成为成熟的富含胆固醇的大颗粒HDL，其与肝脏SR-BI受体结合并被肝脏获取，最后HDL内的胆固醇通过肝细胞代谢，最终经胆汁排泄，从而使集聚在血管内皮下胆固醇排泄至体外，达到缓解甚至逆转AS的作用。RCT是由多种酶、多种受体、多种脂蛋白共同参与的复杂过程，ApoA-I，LCAT和CETP这两个酶在RCT过程中起着极其重要。
　　 抗炎抗氧化功能是HDL的另一个重要的功能。正常功能的HDL颗粒具有强大的抗氧化能力，一方面HDL含有多种抗炎抗氧化酶（如:PON1、ApoA-I），可以中和已形成的Ox-LDL的毒性反应;另一方面，HDL可以抑制氧化因子和炎症因子（如:MPO、LPO、SOD）的毒性作用，减少机体的炎症瀑布链反应，从而延缓AS的进展。正常情况下，ROS的产生和清除保持平衡状态，在动脉粥样硬化情况下，氧化产物生成大于抗氧化能力产生氧化应激，将导致血管的持续损伤，从而加剧动脉粥样硬化进展。功能异常的HDL容易形成Ox-HDL，而被氧化形成的Ox-HDL不单不具有抗氧化的能力，甚至促进Ox-LDL的形成。
　　 内皮的保护作用是HDL一个重要的功能。一方面HDL抑制单核细胞粘附和迁移到血管壁，刺激内皮细胞修复和增殖，抑制生长因子诱导的血管平滑肌细胞的增生;另一方面，HDL可以促进NOS催化内皮细胞内L-精氨酸产生，促进内皮细胞生成NO;升高血管内皮功能，还可以抑制血小板和白细胞在受损内膜的聚集和粘附，防止内皮功能受损。HDL可以通过多种途径促进eNOS的表达，减少抑制eNOS生成的因素，起到保护内皮功能的作用。
　　 脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)是新近发现的与动脉粥样硬化密切相关，可将Ox-LDL水解成大量的溶血卵磷脂和游离氧化脂肪酸，这些促进动脉粥样硬化作用产物进一步活化粒细胞和Lp-PLA2，正常功能的HDL能结合Lp-PLA2，减少机体游离Lp-PLA2量，从而减少血栓的形成。
　　 Hcy升高同样也会引起多种疾病的发生，尤其增加心脑血管事件的发生的风险。同型半胱氨酸的合成和代谢保持着动态平衡，Hcy高于15.0μmol/L称为高同型半胱氨酸血症（hyperhomocysteinemia，高Hcy）。Hhcy是除高血压、高脂血症、吸烟、肥胖、心脑血管病家族史的一个新的独立的AS的危险因素，并且Hcy水平和血管危险之间呈正性相关关系。血浆Hcy每升高5μmol/L，缺血性心脏病发生率增加32％，卒中发生率增加59％，血浆Hcy每降低3μmol/L，可使缺血性心脏病风险降低11～20％，脑卒中风险降低15-33％。血浆总Hcy水平每升高5μmol/L则冠心病危险性男性增加60％，女性增加80％，相对危险性男性为1.6，女性为1.8，相当于总胆固醇每升高20mg/dL的危险性，因此高Hcy是冠心病的一个独立危险因素。
　　 脂质学说是动脉硬化的基础，目前国内外对Hcy与脂质学说的关系的研究主要集中在:1、Hcy可以影响脂质代谢，使LDL代谢减慢，最终导致机体LDL-C水平的升高。2、Hcy致LDL-C沉积作用，Hcy可作用于低密度脂蛋白导致其载脂蛋白B的游离氨基巯基化，形成Hcy与LDL复合物，这种被巯基化修饰的LDL可以不受负反馈抑制被巨噬细胞吞噬，胞内降解增加，引起胞内胆固醇堆积。3、Hcy致脂质氧化致炎作用:Hcy含自由巯基，可以自身氧化成Hcy混合性二硫化物和Hcy硫内酯，同时产生大量过氧化物，引起蛋白质损伤，清除氧自由基的酶活性降低，使得细胞和组织发生炎症反应，同时产生大量的Ox-LDL，加剧AS进展。
　　 HDL是心血管的保护因素之一，但其与Hcy的关系目前尚无明确的定论。Barter对近年HDL与HCY的关系进行综述发现，既有研究认为Hcy能影响HDL的功能，又有部分研究发现Hcy不影响HDL的功能。然而，越来越多的研究发现，Hcy可以通过影响HDL的某些酶的活性而影响HDL的功能，HCY通过影响PON1酶的活性，而影响HDL抗炎抗氧化功能。Clifford研究发现，HCY与CETP酶的活性密切相关，Hcy浓度升高可以影响CETP酶的浓度，而CETP是HDL代谢过程中的重要酶之一。然而HDL功能包括RCT功能、抗炎、抗氧化、维持细胞内皮稳定等功能，PON1和CETP仅仅是HDL众多功能酶中的一个，因此PON1活性和CETP酶并不能反映HDL的整体功能。Hcy通过影响PON1活性和CETP而调节HDL功能仅是其作用靶点之一，高Hcy可能通过更多的机制影响HDL功能。
　　 二研究目的：
　　 本研究通过研究探讨Hcy和MTHFR基因与正常HDL-C患者冠状动脉硬化的关系，探讨Hcy与冠心病患者冠脉病变程度的相关性。通过检测高Hcy患者和对照组患者(两组患者HDL水平均在正常范围)HDL颗粒中的Apo-AI，LCAT、CETP酶的含量，探讨高Hcy对HDL的RCT功能的影响。通过检测HDL颗粒中PON1、MPO活性，Lp-PLA2、LPO、SOD和eNOS水平，探讨高Hcy对HDL抗炎抗氧化能力的影响，从而为预防和治疗冠状动脉粥样硬化提供新靶点。
　　 三实验方法：
　　 1.1研究患者入选标准、分组和排除标准
　　 本研究随机入选2011年1月～2012年6月佛山市顺德第一人民医院住院患者123例，入选患者全部采集吸烟史、高血压病史、糖尿病史、冠心病家族史和其他既往病史。根据根据美国心脏协会(AHA)推荐，正常空腹血浆同型半胱氨酸水平高于15.0μmol/L，则可诊断为高同型半胱氨酸血症，根据是否存在Hcy升高分为正常对照组和高Hcy组。两组入选人群的HDL-C均正常范围（1.16μmmol/L＜HDL-C＜1.55μmmol/L）。所有患者均签署知情同意书，如未取得知情同意，退出实验。排除标准:1、慢性肾功能不全患者、接受肾脏移植的患者;2、甲状腺功能亢进或甲状腺功能低下;3、肝功能受损或者既往存在肝脏病变患者;4、恶性贫血、急性白血病、癌症;5、目前或近期正口服甲氨蝶呤、茶碱、B族维生素及叶酸患者。根据入选标准、排除标准、符合HDL-C水平和是否签署知情同意书，有33例患者未纳入研究，共90例患者入选该研究，其中对照组35例，高HCY组55例。
　　 1.2血样的采集、保存和生化指标测定
　　 早晨8:00前抽取受试者空腹静脉血，部分静置离心放-80℃保存。部分血清及全血立即送顺德第一人民医院检验科用日立7600-210ISE型全自动生化分析仪测定测定:TC、TG、HDL-C、LDL-C、Apo-AI、Apo-B、FBS、PBS、Cr、BUN、hs-CRP。
　　 1.3血浆Hcy的测定
　　 采用Agilent l100液相色谱仪，分别由不同的两人在同一天来测定，准确性和重复性均符合要求。批内变异为3.7％，批间变异为4.1％;质控样品测定结果偏差低水平点小于20％，中、高水平点测定结果偏差小于15％;样本两次测定值误差不超过15％;如果误差大于15％则重新测定，直到误差小于15％。
　　 1.5 MTHFR基因型测定
　　 抽提空腹静脉血离心后得到的白细胞中的基因组DNA后，MTHFR C677T多态性位点基因型检测采用PCR-RFLP方法检测MTHFR基因分型，再通过2％琼脂糖凝胶电泳分开得到不同长度的片段。
　　 1.6冠脉病变情况
　　 所有患者均利用Philip H3000造影机进行冠状动脉造影采集影像，冠脉病变情况由2位专科医师仔细分析，意见有不一致时由第3人核实确定。按病变累及左前降支，左回旋支与右冠状动脉的支数，分为单支，双支和多支病变组;根据美国心脏协会规定的冠状动脉血管图像记录分段评价标准，采用Gensini积分系统对各支血管病变程度进行定量评定。
　　 1.7高密度脂蛋白的分离
　　 采用密度梯度离心法分离高密度脂蛋白，BCA法测定其浓度。
　　 1.8 HDL逆转运酶的检测
　　 采用酶联免疫吸附剂盒测定HDL颗粒中的LCAT和CETP酶的量。
　　 1.9 HDL抗炎抗氧化功能的测定
　　 采用酶联免疫吸附剂盒测定HDL颗粒中的eNOS和Lp-PLA2酶的量。采用分光光度计法测定PON1、MPO酶的活性和LPO、SOD的量。
　　 1.10统计学分析
　　 所有计量资料均以均数±标准差（(x)±s）表示，并采用SPSS13.0统计软件进行统计分析，计量资料采用两样本t检验，计量等级资料采用两独立样本秩和检验，计数资料采用例(％)表示，采用卡方检验，最后进行两等级变量间的Spearman相关性分析、两计数资料进行Pearson相关性分析和多元线性回归方法;P≤0.05为差异有统计学意义。
　　 四结果：
　　 人口学特点比较
　　 与对照组相比（12.4±1.58mmol/L），高Hcy组(18.99±2.71 mmol/L)患者的血清Hcy浓度明显升高(P=0.000)，差异具有统计学意义。比较对照组和高Hcy组患者的年龄(x2=0.407，P=0.685)、性别分布情况(x2=0.003，P=0.959)、高血压患者(x2=0.421，P=0.517)、糖尿病患者(x2=0.778，P=0.378)，吸烟患者(x2=1.014，P=0.314)差异无统计学意义。
　　 两组患者的实验室指标比较
　　 比较对照组和高Hcy组患者的TC(t=0.534，P=0.595)、TG(t=0.457，P=0.649)、HDL-C(t=1.347, P=0.181)、LDL-C(t=0.650, P=0.517)、Apo-B(t=1.426,P=0.147)、空腹血糖(t=0.687，P=0.494)、餐后2h血糖（t=0.484，P=0.630）、Cr(t=0.301, P=0.764)、BUN(t=0.443, P=0.659)、ALT(t=0.716, P=0.476)、AST(t=1.725，P=0.088)间差异无统计学意义。入选两组患者生化指标情况一致，具有可比性。
　　 两组患者冠心病冠脉造影结果的比较
　　 对照组相冠脉多数无明显狭窄，或以单支病变为主，而高Hcy组患者冠脉病变程度严重，以单支和双支病变为主，对两组患者进行卡方检验发现，两组患者冠脉病变情况有差异，同时差异具有统计学意义(x2=17.731，P=0.000)。再进行冠脉评分发现，高Hcy组患者冠脉积分情况较对照组升高，差异具有统计学意义(t=4.222，P=0.000)。
　　 两组患者MTHFR基因分型比较
　　 与对照组MTHFR基因分型以纯合型为主相比，高Hcy组患者MTHFR基因分型以杂合型的CT型为主，同时存在纯变异型TT型2例，进行卡方检验发现，两组患者分型有差异，同时差异具有统计学意义(x2=7.463，P=0.024)。
　　 MTHFR基因分型与血浆Hcy水平及冠脉病变严重程度相关性分析
　　 血浆Hcy水平与MTHFR基因分型呈正相关(r=0.258，P=0.014)，但相关关系并不密切。冠脉病变程度(r=0.600，P=0.000)和冠脉积分(r=0.621，P=0.000)与MTHFR基因分型呈正相关。Hcy水平与冠脉积分存在正相关(r=0.641，P=0.000);Hcy水平与冠脉病变程度也呈正相关（r=0.438，P=0.000），但相关关系并不密切。最后，我们对冠脉积分与其他指标进行多元线性回归分析，以冠脉积分为因变量，其他变量为自变量，模型纳入MTHFR分型基因、HCY、TC、Apo-AI水平模型有统计学意义(F=45.923，P=0.000)。MTHFR基因分型(t=7.851，P=0.000),HCY(t=5.805, P=0.000)、TC(t=2.748, P=0.007)、Apo-AI(t=-2.253,P=0.027)水平对冠脉积分有显著影响，差异具有统计学意义。
　　 高Hcy对Apo-AI的影响
　　 与对照组比较（1.27±0.12mmol/L），高Hcy组患者Apo-AI明显降低（1.21±0.13mmol/L）显著降低，差异均有统计学意义(t=2.28，P=0.025)。
　　 高Hcy对LCAT酶的影响
　　 与对照组比较（1029.02±133.88 U/mg），高Hcy组患者LCAT酶（913.20±117.42 U/mg）显著降低，差异均有统计学意义（t=4.318，P=0.000）。
　　 高Hcy对CETP酶的影响
　　 我们对HDL的重要代谢酶CETP检测发现，高Hcy组（26.33±4.13 ug/mg）患者CETP酶比对照组（34.70±4.72 ug/mg）明显降低，差异均有统计学意义(t=8.854，P=0.000)。
　　 高Hcy对PON1的影响
　　 与对照组比较（450.55±48.55 U/ml），高Hcy组患者PON1活性明显降低（206.48±75.02U/ml）显著降低，差异均有统计学意义（t=17.087，P=0.000）。
　　 高Hcy对MPO酶的影响
　　 我们对MPO活性检测发现，高Hcy组（5.02±2.02U/L）患者MPO活性比对照组（3.15±1.49U/L）明显升高，差异均有统计学意义（t=4.737，P=0.000）。
　　 高Hcy对Lp-PLA2酶的影响
　　 与对照组比较（37.35±8.85 ng/mg），高Hcy组患者Lp-PLA2酶明显降低（31.80±6.91 ng/mg）显著降低，差异均有统计学意义(t=3.326，P=0.001)。
　　 高Hcy对LPO酶的影响
　　 与对照组比较（0.82±0.09 umol/gprot），高Hcy组患者LPO量明显降低（0.93±0.9 umol/gprot）显著升高，差异均有统计学意义(t=5.583，P=0.000)。
　　 高Hcy对SOD和eNOS的影响
　　 与对照组比较（190.32±44.57U/ml），高Hcy组患者SOD活性(204.30±49.37U/ml)升高，但差异无统计学意义(t=1.360，P=0.177)。我们再对eNOS活性检测发现，高Hcy组（5.02±2.02 ug/mg）患者eNOS活性比对照组（3.15±1.49 ug/mg）升高，但两者差异均无统计学意义(t=1.338，P=0.184)。
　　 五结论：
　　 1.高Hcy组患者冠脉病变程度严重，冠脉积分情况较对照组升高，Hcy水平与冠脉积分存在正相关，提示高Hcy可能是冠心病的一独立危险因素。
　　 2.高Hcy组患者MTHFR基因分型以杂合型的CT型为主，同时存在少量纯变异型TT型;冠脉病变程度和冠脉积分呈与MTHFR基因分型呈正相关。
　　 3.高Hcy可能通过降低HDL颗粒中Apo-AI量，降低LCAT、CETP酶量抑制HDL的RCT功能，促进动脉粥样硬化的进展。
　　 4.高Hcy通过降低PON1活性，减少HDL颗粒中Lp-PLA2量抑制HDL的抗炎抗氧化能力，促进动脉粥样硬化的进展。
　　 5.高Hcy通过升高MPO活性，增加HDL颗粒中LPO量而降低HDL的抗炎抗氧化功能，从而促进动脉粥样硬化的进展。
　　 6.高Hcy并不影响HDL颗粒中SOD和eNOS水平，该结果尚需进一步探讨。
　　 7.综上所述，高Hcy组患者冠脉病变程度严重，Hcy水平与冠脉积分呈正相关，提示高Hcy可能是冠心病的一独立危险因素，机制可能与Hcy患者HDL抗AS功能减弱（失功能）有关:高Hcy患者HDL颗粒中Apo-AI、LCAT、CETP含量减少，抗炎抗氧化功能减弱，导致HDL的功能下降，促进动脉粥样硬化的进展。降低血浆Hcy水平，可能改善HDL的功能，降低Hcy可能成为治疗动脉粥样硬化的靶点之一。

目录

摘要

前言

高密度脂蛋白与动脉粥样硬化

同型半胱氨酸与动脉粥样硬化和HDL

主要实验材料与仪器

一．主要实验试剂及溶液

二．主要实验仪器

第一部分：Hcy基因多态性与冠脉病变程度的相关性研究

1．实验方法

研究结果

3 讨论

第二部分：高Hcy对HDL逆转运酶及载脂蛋白AI的影响

1．实验方法

2．研究结果

3．讨论

第三部分：高Hey对HDL抗炎抗氧化功能的影响

1．实验方法

2．结果

3．讨论

全文结论

参考文献

攻读学位期间成果

中英文缩略词表

致谢

声明

统计学证明