CD147的表达与前列腺癌进展的关系和甲基化的初步研究

摘要

研究背景和目的:
　　 前列腺癌是一种常见的男性泌尿系统肿瘤，并且在美国的男性肿瘤死亡率排名第二[1]。虽然局限性前列腺癌患者在成功地接受根治性前列腺切除术或者放射性治疗后能够获得良好的治疗效果，但是前列腺癌患者往往死于激素难治性肿瘤和肿瘤远处转移。在实际的临床工作中，由于各种客观原因以及缺乏特异性的诊断标准，使泌尿外科医生对于辨别哪部分前列腺癌患者术后可能出现肿瘤进展、肿瘤复发，需要及时给予进一步的辅助治疗这个问题上产生一定的困难。前列腺癌患者的预后情况根据肿瘤的临床分期和病理分级呈现多种的变化。许多科研人员希望寻找前列腺癌的特异性分子标记物来帮助临床医生解决临床上所遇到的困境。研究发现许多敏感度高的新型前列腺癌分子标记物与肿瘤的生物学侵袭行为有关，并且能够对疾病的诊断和治疗产生重要的临床价值。现阶段，如何有效地治疗前列腺癌的转移已经成为前列腺癌治疗方法的一个重要难题[2]。最近，许多研究的焦点集中在如何利用各种预测前列腺癌预后情况的临床指标来建立一个诊断模型准确地提供必要的临床信息[3-5]。前列腺癌肿瘤细胞根据其所属种类具有高度或者低度的肿瘤转移潜能，包括细胞分化、细胞间粘附、细胞侵袭力和细胞运动力。这些促进肿瘤进展的因素都是正常机体细胞向肿瘤细胞转变过程中相应基因改变的结果。因此，寻找和发现一个能够准确地预测前列腺癌进展、复发和转移的新型分子标记物将会使我们进一步地了解前列腺癌的潜在机制，为前列腺癌患者提供更有效的靶向治疗，达到更好的治疗效果。细胞外基质金属蛋白酶诱导剂，又叫CD147，是一类相对分子质量为50000-60000属于免疫球蛋白超家族(immunoglobulin superfamily，IGSF)的跨膜糖蛋白。CD147分子在人体内分布非常广泛，参与炎症反应、精子发生、胚胎发育等各种不同的生理过程。不仅如此，CD147分子已经被广泛证实在多种恶性肿瘤细胞表面高度表达[6]。研究发现CD147通过诱导细胞外基质金属酶（MMPS）的合成参与肿瘤的转移和增强肿瘤的侵袭力。肿瘤侵袭和转移是多步骤的复杂过程，包括基底膜降解、基质渗透以及肿瘤细胞进出血管和对靶组织的侵袭。其中肿瘤周围基底膜的降解是肿瘤细胞向邻近纤维结缔组织浸润进而向远处转移过程中最基本的一步。所有这些都要求由MMPS等蛋白水解酶来介导基底膜组成成分和细胞外基质大分子的重塑。除此以外，CD147增强肿瘤侵袭性的途径包括激活ERK1/2和p38丝裂原活化蛋白酶通路促进肿瘤细胞的分化，通过PI3K-Akt信号旁路来调节血管生长因子(VEGF)的表达来促进肿瘤内血管生长，通过产生透明质烷增强肿瘤细胞抵抗化疗药物的能力和通过抑制Bim加强肿瘤细胞抵抗碱性环境的能力[7-11]门。还有文献报道，抑制CD147的表达可以激活半胱天冬酶-3，从而降低细胞的稳定性和导致DNA断裂[10]。另外，CD147的表达与乳腺癌、黑色素瘤、肝癌等肿瘤的临床预后相关[2,13,14]。Zou W等使用RNA干扰技术抑制CD147的基因表达不但可以降低肿瘤的侵袭力和恶性程度，还可以增强肿瘤细胞对紫杉醇类化疗药物的敏感性[15]。虽然关于CD147在肿瘤进展过程中的作用已经引起肿瘤学界的关注，但是关于CD147与良性前列腺增生、肿瘤转移病变和不同前列腺癌分期的之间的联系，特别是CD147的表达与无PSA生化复发生存率、无肿瘤远处转移生存率的关系仍然未有相关的报道。本次研究主要对240例确诊为前列腺癌的石蜡组织标本进行CD147的免疫组化分析，每例前列腺癌标本都有明确的Gleason评分和详细的临床病理资料。我们利用统计学原理分析CD147表达与所有病例的无PSA生化复发生存率，无肿瘤转移生存率和总体生存率之间的关系，揭示CD147在肿瘤进展过程中所起的重要作用。研究目的在于说明CD147参与前列腺癌转移、复发等不良预后过程和证明CD147是否能够成为一个预测前列腺癌生化复发、转移进展和预期寿命的独立指标。另外，当正常的前列腺组织发生癌变时，细胞可能发生许多分子水平上的异常，如基因启动子甲基化异常、促癌基因的高表达等，根据表观遗传调控在肿瘤发病中的理论研究基础，我们也在本课题中对CD147的甲基化情况进行初步的探讨，验证甲基化修饰水平是否能够调控CD147在前列腺癌中的表达。
　　 材料:
　　 临床病例
　　 从1993年至1995年期间，共240名前列腺癌患者在哈佛医学院附属麻省总医院(MGH，Boston，MA)接受根治性前列腺切除术治疗，术后前列腺癌组织制作成石蜡切片后纳入本次研究中。凡是在术前或者术后曾经接受雄激素治疗或者放射性治疗的病例均被排除在实验组外。所有实验组前列腺癌组织标本均经过H-E染色并由病理科医生明确诊断。病理科医生根据现行的前列腺癌病理分级评分标准(International Society of Urological Pathology)[16]对全部240例标本进行Gleason评分，每例标本中最高Gleason评分的前列腺癌部分均被用于制作前列腺癌组织芯片。每例标本均记录以下相关临床数据:年龄，术前PSA水平，Gleason评分，美国癌症联合委员会(American JointCommittee on Cancer)病理肿瘤分期，手术切缘情况，PSA生化复发情况和时间，术后肿瘤转移情况和时间和总体生存时间。无PSA生化复发生存时间指手术当天至首次发现连续两次血清PSA水平升高之间的时间间隔;无肿瘤远处转移生存时间指手术当天至首次发现肿瘤转移病灶之间的时间间隔;总体生存时间指手术当天至随访结束或者患者死亡之间的时间间隔。用于甲基化研究的临床病例，由广州市第一人民医院提供。我们的研究经过麻省总医院伦理委员会和中华人民共和国卫生部批准。
　　 组织芯片制作
　　 病理科医生使用手动组织芯片制作工具(Beecher Instruments，SilverSpring，MD)进行前列腺癌组织芯片的制作。首先，240例前列腺癌标本制作成石蜡切片后进行H-E染色，病理医生反复查看并确定每例标本的Gleason评分，在每例标本上标记GS最高的位点。然后根据标记，使用直径0.6毫米的组织穿刺针从石蜡块中抽取需要的样本并按顺序排列在玻片上。每块玻片上都含有远离癌旁的正常前列腺组织作为对照。另外，还有20例正常前列腺组织用作免疫组化分析的阴性对照。最后，组织芯片经H-E染色后再次进行确认。
　　 方法:
　　 使用Real-time PCR和Western blot对各种良恶性前列腺细胞株进行CD147表达水平的检测;以不同浓度(0，2.5，5，7.5，10uM)的甲基化抑制药物5-Aza-2'-deoxycytidine处理P69和PC3细胞，验证药物处理后CD147表达水平的变化;使用甲基化特异性检测试剂盒，分别对细胞株及临床石蜡样本进行CD147启动子甲基化分析;最后对CD147表达阳性的前列腺癌标本进行焦磷酸测序，从基因测序方面直接对甲基化定性定量。240例石蜡标本按照5微米的厚度进行切片，使用二甲苯溶液脱蜡，重新水化后的组织芯片留待H-E染色或者免疫组化。经过蛋白水解消化和过氧化酶封闭组织玻片等步骤后，加入浓度为1∶1000的一抗在4C环境中过夜孵育。经过洗涤和二抗孵育后，在显微镜下观察CD147的染色情况。确认染色程度满意，使用苏木紫溶液复染，封片。正常前列腺组织用作为阴性对照。每块组织玻片分别由两位经验丰富的病理科医生独立观察，所有关于临床病理和治疗效果的患者资料均对观察者隐瞒。最后的观察结果由两位医生进行比对后确定，任何存在分歧的部分均重新观察和讨论后得出一致的结果。CD147表达阳性结果定义为在10个代表性显微镜下区域发现细胞的表面或者细胞质中出现CD147表达。如果超过5％的肿瘤细胞出现CD147表达则定义为CD147阳性表达。
　　 统计学分析:统计学分析分别由两位统计学专家使用SAS9.2版本(SAS Institute，Cary，NC)独立完成，两组结果经过校对后确定最终结果。所有的连续变量均表示为X±s。所有四格表资料均使用Fisher精确检验，非四格表记数资料使用Pearson卡方检验。在单因素和多因素分析中，Cox比例危险模型用于计算CD147的表达与无PSA生化复发生存率、无肿瘤远处转移生存率和总体生存率之间的关系。Kaplan-Meier法主要用于生存曲线分析并经过log-rank检验。CD147表达情况与各种临床数据之间的关联使用两独立样本t检验和x2检验方法验证。P＜0.05代表具有统计学意义。
　　 结果:
　　 CD147在前列腺癌患者肿瘤组织中的表达情况和位置
　　 我们使用中国第四军医大学生物研究中心提供的CD147抗体对前列腺癌组织芯片进行免疫组化实验。CD147抗体主要聚集在前列腺癌细胞膜和细胞质中，染色的程度分为低、中、高程度。前列腺癌组织的CD147阳性表达率为47.08％[113/240]，而前列腺组织的CD147阳性表达率为5％[1/20]，二者差别有统计学意义(P=0.006)。我们对CD147阳性表达情况和相，关的各项临床病理数据进行统计学分析，发现CD147的表达与Gleason评分(P=0.0002)，手术切缘肿瘤阳性(P＜0.0001)，无PSA生化复发生存率下降(P＜0.0001)，无肿瘤转移生存率下降(P＜0.0001)和总体生存率下降(P＜0.0002)存在重要联系。在Kaplan-Meier生存分析中，CD147的阳性表达能够降低无PSA生化复发生存率、无肿瘤转移生存率和总体生存率。
　　 CD147的表达情况与手术效果之间的关系
　　 单因素分析表明CD147的表达和Gleason评分都可以作为前列腺患者无PSA生化复发生存时间、无肿瘤转移生存时间和总体生存时间的重要预测指标(P＜0.05)。分析也提示术前血清PSA水平(P＜0.001)，临床病理分期(P=0.0023)和手术切缘情况(P=0.0036)只能够预测前列腺癌患者无PSA生化复发生存时间。多因素分析表明CD147的表达和Gleason评分均可以作为前列腺癌患者无PSA生化复发生存时间，无肿瘤转移生存时间和总体生存时间的独立预测指标(P＜0.05)。另外，术前血清PSA水平只可以独立预测无PSA生化复发时间，而临床病理分期和手术切缘情况均对预测前列腺癌预后情况无统计学意义。
　　 CD147的表达情况与Gleason评分、临床病理分期之间的关系
　　 Gleason评分是至今为止判断前列腺癌患者预后情况的最可靠指标。本次研究中我们发现CD147的阳性表达率随着G]eason评分的升高而上升。无论是单因素分析还是多因素分析都表明两者是前列腺癌患者无PSA生化复发生存时间、无肿瘤转移生存时间和总体生存时间的重要预测指标。Kaplan-Meier生存曲线显示在Gleason≤6和Gleason=7分组中，CD147的阳性表达与无PSA生化复发生存时间的降低有关，但是在
　　 Gleason≥8分组中这种关系无统计学意义。至于总体生存率方面，CD147的表达在Gleason≤6分组中存在统计学意义(p=0.0160)。另外，Kaplan-Meier生存曲线显示CD147的表达在高分期(pT3)(p＜0.0001和p=0.0028)和低分期(pT2)(p＜0.0001和p=0.0253)的病例中都与无PSA生化复发生存时间和总体生存时间有关。
　　 CD147启动子甲基化情况
　　 P69细胞经过甲基化抑制药物处理后，基因表达水平和蛋白表达水平随着药物浓度的增加呈现上升趋势，而PC3细胞的CD147表达量并未发生明显改变。P69和RWPE-1的甲基化检测实验呈现阳性结果，说明CD147启动子检测序列中存在5个以上的甲基化CpG位点，而PC3等前列腺癌细胞株均呈现阴性结果。同样，前列腺增生的甲基化检测呈现阳性结果，而CD147表达阳性的前列腺癌标本则呈现阴性结果。焦磷酸测序结果显示3例前列腺癌标本（CD147表达阳性）启动子区域的6个CpG位点甲基化修饰程度低，百分比均未超过10％。
　　 结论:
　　 1.与正常的前列腺细胞相比，CD147在前列腺癌中的表达明显增强。
　　 2.CD147的表达与Gleason评分，手术切缘情况，血清PSA生化复发，术后肿瘤转移和肿瘤患者总体生存时间存在重要联系。
　　 3.CD147表达阳性可能降低前列腺癌患者的无PSA生化复发生存率、无肿瘤转移生存率和总体生存率。
　　 4.CD147的表达情况可能作为除Gleason评分外的一个独立判断前列腺癌患者预后情况的预测指标。
　　 5.CD147的表达不仅可以预测pT2期前列腺癌患者的无PSA生化复发生存率和总体生存率，而且也可以应用于pT3期前列腺癌患者的预后判断中。
　　 6.CD147的表达可以预测Gleason≤6的前列腺癌患者的无PSA生化复发生存率和总体生存率，但是不能应用于高Gleason评分的患者中。
　　 7.我们的研究结果表明CD147参与前列腺癌的发展转移。CD147在日后可能发展成为一种新型前列腺癌诊断工具，结合术前血清PSA水平、Gleason评分，AJCC肿瘤分期和手术切缘情况等当今用于评估肿瘤预后的临床病理指标，构建完善的前列腺癌诊断模型。
　　 8.CD147启动子的低甲基化现象可能是CD147在前列腺癌组织中高度表达的潜在调控机制。

目录

摘要

前言

材料

1．1 实验器材

1．2 实验试剂

1．3 前列腺癌组织来源及临床资料

1．4 统计分析软件

1．5 电脑分析软件

方法

2．1 试剂配备

2．2 细胞培养基配备

2．3 细胞培养和传代

2．4 细胞RNA提取(TRIzol法)

2．5 细胞DNA提取方法(过柱法)

2．7 DNA提纯(过柱法)

2．8 Endpoint PCR

2．9 SYBR GreenⅠ染料法实时定量荧光PCR

2．10 基因甲基化检测试验

2．11 Western Blot

2．12 焦磷酸测序

2．13 标本选取方法

2．14 组织芯片制作方法

2．15 HE染色

2．16 免疫组化染色

结果

3．1 CD147在各种前列腺细胞株中的表达情况

3．2 甲基化抑制剂5-Aza-2'-deoxycytidine处理P69和PC3细胞株后CD147表达情况变化

3．3 基因甲基化特异性检测(Methylation Detection)

3．4 前列腺增生组织和前列腺癌石蜡标本基因组DNA的CD147甲基化检测结果

3．5 焦磷酸测序

3．6 HE染色图(前列腺癌组织)

3．7 免疫组化图

3．8 免疫组化分析结果

3．9 CD147表达与前列腺癌各项相关临床病理指标的关系

3．10 CD147表达与前列腺癌预后的关系(无PSA生化复发生存率，无肿瘤转移生存率和总体生存率Kaplan-Meier生存曲线分析)

3．11 CD147和各项相关临床病理指标对生存率影响的单因素和多因素分析

3．12 CD147表达在不同前列腺癌病理分期的无PSA生化复发生存率和总体生存率分析

3．15 CD147表达在不同Gleason评分下的无PSA生化复发生存率和总体生存率分析

讨论

总结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的论文

致谢

声明

统计学审稿证明