脂质微泡—双配体紫杉醇纳米粒复合物的制备及其体外生物性能评价

摘要

目的：超声靶向微泡破坏(ultrasound targeted microbubble destruction，UTMD)技术是一种较具应用前景的的靶向给药方法，通过在特定部位发射不同声强的超声波，致微泡在超声作用下破裂，产生空化效应及微声流、微射流、声化学、冲击波等反应，使细胞间隙增宽，膜通透性增加，细胞表面一过性小孔形成（声孔效应），从而促进药物通过血管内皮屏障到达特定部位，提高药物摄取。UTMD能靶向传输抗癌药物，提高肿瘤局部药物浓度。该技术以微泡作为药物载体，微泡的中心包裹气体，实际应用中由于气体的存在药物包载量不够高，且流体环境下微泡性能不稳定，半衰期短。紫杉醇(paclitaxel，P)是抗癌药物中应用最广泛的药物之一，能够诱导和促进微管蛋白聚合及组装，抑制肿瘤细胞的有丝分裂，从而抑制肿瘤细胞增殖。但它用于治疗时的毒副作用大，主要表现为对骨髓的抑制，对肾脏、心脏及对神经系统的毒性作用。紫杉醇水溶性差，为化学脂溶性，临床应用时需以聚氧乙烯蓖麻油和酒精助溶，不仅有全身毒副作用，还易产生过敏反应。生物大分子具有良好的生物相容性及可降解性，在肿瘤组织具有提高渗透和滞留作用的特点(enhanced permeability and retention effect，EPR效应)，其载药量大、缓释性好、性能稳定，是一种较理想的增溶脂溶性抗癌药物的载体。本课题选用具有良好水溶性、生物相容性、生物降解性、非免疫原性、无毒的天然生物大分子肝素作为药物载体，通过功能化修饰改善其两亲性质，物理包裹疏水性抗癌药物紫杉醇，水溶性条件下自组装形成载紫杉醇聚合物纳米粒，从而提高药物水溶性、降低原药毒副作用并进一步提高药物生物利用度。尽管纳米粒作为药物载体具有诸多优势，但由于其粒径小，易于在靶器官/靶组织以外的器官/组织蓄积，不仅可能导致毒性作用，更降低了药物在靶器官/靶组织局部的作用浓度。基于两种体系的优势与不足，我们拟通过生物素-亲和素桥连作用将脂质超声造影剂与载紫杉醇聚合物纳米粒偶连，借助微泡爆破产生的生物学效应，构建一种超声实时监测下实现药物定向释放的新型载药系统。内皮屏障和细胞膜是基因和药物到达病变组织时遇到的主要屏障，肿瘤组织中缺乏淋巴引流导致间质压力增高进一步阻止药物到达肿瘤中心，这是目前肿瘤药物化疗中普遍面临的难题。UTMD导致的声孔效应能够增加内皮间隙和胞膜通透性，同时具有增效化疗药物的作用，但药物进入细胞内仍是随机的，如何引导药物主动跨越“内膜屏障”进入靶细胞内浓聚而不仅仅是弥散在细胞周围或膜表面，提高药物有效浓度，是亟待解决的问题。细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides，CPPs)是一大类由10～30个氨基酸组成、可以携带多种分子主动穿越各种生物膜屏障包括血脑屏障，导入近乎所有细胞的短肽。自穿膜肽发现以来人们利用穿膜肽的转运功能已将蛋白质、抗体、核酸、脂质体、显像剂、细胞毒性药物等多类物质导入细胞，为许多疾病分子水平的诊断、治疗提供了有效手段，但普通穿膜肽缺乏靶向性制约了其进一步在体应用。叶酸(folic acid, FA)是天然存在的小分子物质，几乎无免疫原性，叶酸受体(folate receptor, FR)在包括乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌等在内的大部分恶性肿瘤组织中高度表达，而在正常组织中几乎不表达。为此，我们将穿膜肽的主动穿膜作用与叶酸的肿瘤细胞靶向性结合，碳二亚胺法制备携叶酸、穿膜肽双配体的载紫杉醇纳米粒，之后通过生物素-亲和素桥将微泡与双配体紫杉醇纳米粒偶联，进一步制备多功能微泡-双配体紫杉醇纳米粒复合物，借助叶酸的肿瘤靶向性、穿膜肽的穿膜作用及超声介导下的多种生物学效应促进载药纳米粒主动克服生物学屏障，最终促进肿瘤细胞内有效药物摄取，以期构建一种新型的具有高效药物靶向传输能力的载药系统。
　　 方法：⑴按摩尔比称取一定量的DSPC、DPPE-Biot于三颈瓶中，并加入DiI染料、PEG4000、泊洛沙姆(F188)，加25 mL蒸馏水，于70℃水浴搅拌30min，放冷至室温。把制好的脂质混悬液加入50 mL聚丙烯管内，将剪切刀头插至液面下，通入全氟丙烷气体2 min，以一定的剪切速度剪切一定时间，制得包裹全氟丙烷气体的脂质微泡，分装于西林瓶中充入全氟丙烷气体密闭，制备得到生物素化DiI红色荧光标记的脂质微泡。库尔特计数仪进行粒度分析，激光共聚焦显微镜下观察微泡形态、荧光分布情况。⑵取一定量的肝素钠室温下溶于去离子水中，加入到H+型的交换树脂中进行离子交换后，加入一定量四丁基氢氧化铵溶液中和，冻干后得到四丁基化肝素。按摩尔比取一定量的四丁基化肝素、丁二酸酐以及催化剂量的DMAP冰浴条件下加入到DMF溶液中，待反应物完全溶解后加入一定摩尔量的三乙胺，室温反应，过夜。反应毕将反应液透析后，进行离子交换，冻干后，得到黄色粉末即为羧基化的肝素。⑶按摩尔比称取一定量的D-生物素、NHS加入到70℃的DMF溶液中，待反应物完全溶解后，将反应液冷却至室温;加入催化剂量的DCC，室温反应过夜后，过滤，收集上清液。将上清液加入到含有一定量的三乙胺、乙二胺的5mLDMF溶液中，反应约3～4h。反应液中加入过量乙醚，过滤，得到白色不溶物，即为氨基化的生物素。⑷称取一定量的叶酸以及催化剂量的DCC、NHS加入到25 mL的DMSO溶液中，50℃下避光反应5～6h，过滤，收集上清液。按摩尔比取一定量的三乙胺、乙二胺加入到上清液中，室温，避光反应，过夜。反应毕将反应液滴加进过量乙腈，收集沉淀物。将沉淀物溶于去离子水中，调节溶液呈酸性，过滤。用无水乙醇、无水乙醚反复洗涤沉淀物，得到黄色粉末状固体，即为氨基化的叶酸。⑸按摩尔比称取一定量的羧基化肝素、氨基化生物素、氨基化叶酸、Tat肽以及催化剂量的EDC·HCl、NHS，并加入Oregon green染料，室温下避光反应、过夜。双配体载体制备完后，室温下加入一定量紫杉醇搅拌30 min后，反应液透析48 h后，得到生物素化携叶酸、穿膜肽双配体的Oregon green绿色荧光标记的紫杉醇纳米粒。核磁共振氢谱法测定其结构，动态光散射仪测定其粒径及电位，透射电镜观察其形态，紫外光谱方法测定其载药量。⑹取一定量的生物素化DiI红色荧光标记的脂质微泡，加入链亲和素，洗涤纯化后加入生物素化双配体紫杉醇纳米粒，冰上孵育30 min，洗涤纯化后即制备出脂质微泡-双配体紫杉醇纳米粒复合物。库尔特计数仪进行粒度分析。激光共聚焦显微镜下观察生物素化DiI红色荧光标记的脂质微泡与Oregon green绿色荧光标记的双配体紫杉醇纳米粒的连接情况。用1mg/mL，2mg/mL，3mg/mL的双配体紫杉醇纳米粒与脂质微泡结合形成脂质微泡-双配体紫杉醇纳米粒复合物，低速离心去除未与微泡结合的双配体紫杉醇纳米粒，计算双配体紫杉醇纳米粒与微泡的结合率，求得脂质微泡-双配体紫杉醇纳米粒复合物的载药量。⑺用脂质微泡-双配体紫杉醇纳米粒复合物孵育叶酸受体阳性表达的人乳腺癌细胞MDA-MB-231及叶酸受体阴性表达的人肺癌细胞A549，加入脂质微泡-双配体紫杉醇纳米粒复合物后立即辅以不同的辐照声强及辐照时间（即1.0 W/cma2，40 s;1.5 W/cm2，20 s;1.5 W/cm2，40 s;1.5 W/cm2，60 s），4h后Hochest33342染色细胞核，荧光显微镜下观察不同条件辐照组Oregon green绿色荧光标记的双配体紫杉醇纳米粒在两种细胞内的的分布情况。⑻为评估叶酸和Tat的作用，分别以叶酸紫杉醇纳米粒，Tat紫杉醇纳米粒，双配体紫杉醇纳米粒孵育MDA-MB-231细胞和A549细胞4h后，流式细胞分析仪定量分析两种细胞紫杉醇纳米粒的摄取情况。⑼分别用双配体紫杉醇纳米粒，脂质微泡-双配体紫杉醇纳米粒复合物联合超声辐照，脂质微泡-双配体紫杉醇纳米粒复合物无超声辐照作用于MDA-MB-231细胞和A549细胞，孵育4h后，Hochest33342染核后，激光共聚焦显微镜观察两种细胞各组的细胞核周围及核内的紫杉醇纳米粒分布情况。⑽采用SPSS13.0统计分析软件进行统计学分析，所有数据均以(x)±s表示。MDA-MB-231细胞和A549细胞在(1)空白微泡联合超声辐照，(2)小分子紫杉醇，(3)双配体紫杉醇纳米粒，(4)脂质微泡-双配体紫杉醇纳米粒复合物联合超声辐照条件下的细胞相对存活率的比较均采用One-Way ANOVA，方差不齐则选用近似F检验Welch法进行方差分析，差异性检验水准设为p＜0.05（双侧）。
　　 结果：①脂质微泡的理化性质:制备得到的脂质体微泡(MBs)在激光共聚焦显微镜下观察分布均匀，无聚集现象，单个微泡外观圆整。库尔特计数仪测得MBs浓度约为(11.31±1.0)×108个/mL，粒径为(2.20±0.93)μm。激光共聚焦显微镜下见DiI标记的脂质微泡(DiI-MBs)外壳发出明亮的红色荧光，表明DiI标记的脂质微泡制备成功。②高效液相色谱及质谱分析:合成肽Tat高效液相色谱分析主峰测定值为1559.86 Da，与理论分子量1560 Da基本相符，主峰含量约97.8％，合成成功。③双配体紫杉醇纳米粒的理化性质:动态光散射仪显示双配体紫杉醇纳米粒的粒径约为120-±7 nm，电位约为-35±4 mv。透射电镜下观察纳米粒呈圆形，无明显聚集现象。紫外光谱方法测定其载药量约8.84％。④脂质微泡-双配体紫杉醇纳米粒复合物的理化性质:库尔特计数仪测得其浓度约为(7.78±1.2)×108个/mL，粒径为(2.26±0.86)μm。激光共聚焦显微镜下观察脂质微泡-双配体紫杉醇纳米粒复合物外壳发出明亮的黄色荧光，表明Oregongreen绿色荧光标记的双配体紫杉醇纳米粒与DiI红色荧光标记的脂质微泡外壳连接成功。双配体紫杉醇纳米粒的浓度为2mg/mL时，脂质微泡-双配体紫杉醇纳米粒复合物的载药量最高，即每108个复合物载紫杉醇的量为106.7μg。⑤荧光显微镜下观察MDA-MB-231细胞在辐照声强为1.0 W/cm2，时间为40 s的条件下，Hochest33342蓝色荧光染色的细胞核周围及内部见较多Oregon green绿色荧光标记的双配体紫杉醇纳米粒。而在其他辐照条件下细胞核周围及内部均见较少绿色荧光。A549细胞在辐照声强为1.5W/cm2，时间为40 s的条件下，Hochest33342蓝色荧光染色的细胞核周围及内部见较多Oregon green绿色荧光标记的双配体紫杉醇纳米粒。而在其他辐照条件下细胞核周围及内部均见较少绿色荧光。⑥分别用叶酸紫杉醇纳米粒，Tat紫杉醇纳米粒，双配体紫杉醇纳米粒孵育MDA-MB-231细胞和A549细胞4h后，MDA-MB-231细胞在双配体紫杉醇纳米粒组摄取荧光的量最多，而A549细胞在双配体紫杉醇纳米粒组和Tat紫杉醇纳米粒组摄取荧光的量基本一致。⑦分别用双配体紫杉醇纳米粒，脂质微泡-双配体紫杉醇纳米粒复合物联合超声辐照，脂质微泡-双配体紫杉醇纳米粒复合物无超声辐照作用于MDA-MB-231细胞和A549细胞，4h后在同种作用条件下MDA-MB-231细胞内绿色荧光明显强于A549细胞，且绿色荧光主要分布在MDA-MB-231细胞的细胞核内，A549细胞的细胞质内。以上两种细胞内荧光强度在脂质微泡-双配体紫杉醇纳米粒复合物联合超声辐照组最强，在脂质微泡-双配体紫杉醇纳米粒复合物无超声辐照组最弱。⑧24h后MDA-MB-231细胞及A549细胞的相对存活率依次为空白微泡联合超声辐照组＞小分子紫杉醇组＞双配体紫杉醇纳米粒组＞脂质微泡-双配体紫杉醇纳米粒复合物联合超声辐照组(P＜0.05)。对MDA-MB-231细胞，双配体紫杉醇纳米粒和脂质微泡-双配体紫杉醇纳米粒复合物联合超声辐照的半数抑制浓度分别为45.8μg/mL和17.3μg/mL;对A549细胞，双配体紫杉醇纳米粒和脂质微泡-双配体紫杉醇纳米粒复合物联合超声辐照的半数抑制浓度分别为50.3μg/mL和6.1μg/mL。
　　 结论：⑴成功制备脂质微泡-双配体紫杉醇纳米粒复合物。⑵不同种类细胞对促进药物摄取的最佳辐照参数不一样。MDA-MB-231细胞的最佳超声辐照条件为辐照声强1.0W/cm2，辐照时间4s;A549细胞的最佳超声辐照条件为辐照声强1.5W/cm2，辐照时间40s。⑶超声辐照作用及叶酸、穿膜肽修饰复合物体系，能够协同促进肿瘤细胞对载药纳米粒的摄取，从而抑制肿瘤细胞生长。

目录

摘要

前言

参考文献

第一章 脂质微泡-双配体紫杉醇纳米粒复合物的制备及其表征

1．实验材料

2．实验方法

3．实验结果

4．讨论

参考文献

第二章 脂质微泡-双配体紫杉醇纳米粒复合物的体外生物性能评价

1．实验材料

2．实验方法

3．实验结果

4．讨论

5．结论

参考文献

缩略词表一

缩略词表二

成果

附录

致谢

声明