PI3K/Akt信号通路介导骨髓间充质干细胞来源的膜微囊对谷氨酸损伤PC12细胞的保护

摘要

[背景] 脑卒中，也称脑血管疾病(Cerebral vascular disease，CVD)，是指各种病因使脑血管发生病变而导致脑功能缺损的一组疾病的总称。脑卒中又可分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中，其中缺血性脑卒中发病率较大，占所有急性脑血管疾病的80％～90％。脑血管疾病以其高发病率、高病死率和高致残率严重影响着人们的生存及生活质量，是目前临床常见的难治性疾病。目前临床用于治疗脑梗死的方法包括改善脑血循环、促进脑代谢、脱水、使用抗凝药物等，尽管有各种各样的方法被用于治疗脑卒中，但是这些方法均不能对脑梗死后缺血区神经细胞损伤起到有效的保护作用。另外虽然溶栓治疗具有较好的改善血液循环的效果，但溶栓治疗由于时间窗短，发病3～6小时之内的病人才能进行溶栓，因而限制了这种方法的广泛应用。因此，寻找有效的治疗脑卒中的方法，是当务之急。 干细胞移植治疗脑卒中已取得了一定的研究成果，多种实验均证实干细胞移植治疗疾病的有效性，并已进入前期临床实验。间充质干细胞是一种具有多向分化潜能的干细胞，由于其易获得性、免疫源性低，且具有分泌多种营养因子以及损伤修复等作用，在移植物抗宿主性疾病、骨和软骨疾病、心脏疾病、神经损伤性疾病中得到了广泛应用。近年来，随着对间充质干细胞研究的深入，人们发现其发挥作用的机制并非简单局限在移植后定向迁徙到损伤部位，与宿主细胞发生整合，或分化并替代损伤细胞，而更有可能与移植间充质干细胞能够分泌多种营养因子及释放出含遗传信号和/或营养物质的膜微囊等物质有关。 [目的] 通过将大鼠骨髓间充质干细胞来源的膜微囊(rBMSC-MV)作用于谷氨酸兴奋性损伤的PC12细胞模型，验证rBMSC-MV对PC12细胞存活、抵御谷氨酸兴奋性损伤的作用，以及MV、谷氨酸共同作用于PC12细胞后，对细胞p-Akt、Bcl-2、Bax、caspase-3等信号通路相关蛋白表达的影响，探究rBMSC-MV对神经兴奋性损伤的保护作用及其可能的相关机制。 [方法] 1.rBMSC提取、培养与鉴定 从SD大鼠中提取rBMSC并进行培养，显微镜下观察细胞形态。利用特定诱导剂诱导后对rBMSC成骨、成脂分化能力进行鉴定;利用流式细胞术检测骨髓间充质干细胞特异性表面标志CD29、CD31、CD34、CD44、CD45。 2.膜微囊的制备、提取与鉴定 选择传代至3～5代的BMSC进行低氧处理。细胞贴壁并生长融合至70～80％时，吸弃原培养基，用PBS（磷酸盐缓冲液）或无血清培养基洗涤细胞2～3遍。随后，将培养基更换成新鲜培养基，将细胞放入含1％O2、5％CO2的低氧培养箱中处理72h。低氧完成后，无菌条件下收集细胞上清，差速离心法去除其中含有的死细胞、细胞碎片等，再经0.22μm的滤膜过滤，在4℃，100，000×g条件下，进行超速离心1h后再重复超速离心一次，以提取纯净的MV。用一定体积的PBS重悬MV后，-80℃保存。根据Bradford蛋白定量法测定MV相关的蛋白浓度。电子显微镜下观察rBMSC-MV形态，并用流式细胞术对rBMSC-MV表面标记进行鉴定。 3.PC12细胞谷氨酸损伤模型的制备 将浓度分别为0，0.5mM，1mM，5mM，10mM的谷氨酸分别加入PC12细胞中，并按浓度不同分为不同组。在谷氨酸作用24，48，72h后，用MTT检测试剂盒检测不同组细胞活性、LDH检测试剂盒检测不同组细胞LDH释放量，观察谷氨酸对细胞活性以及膜通透性的影响，找出合适的作用浓度与时间，建立PC12细胞谷氨酸损伤模型。 4.MV对PC12细胞谷氨酸损伤模型的作用 将浓度为0，1μg/mL，10μg/mL，20μg/mL的MV加入PC12细胞损伤模型，并作用48h，利用MTT、LDH检测试剂盒、Annexin-V/PI凋亡检测试剂盒等，观察MV对谷氨酸损伤PC12细胞的作用。 5.PI3K/Akt通路介导MV保护作用机制的探讨 通过Western Blot技术联合PI3K/Akt通路抑制剂LY294002，观察MV对PC12细胞Akt磷酸化时间与磷酸化程度的影响，MV与谷氨酸损伤PC12细胞的Akt磷酸化、Bcl-2，Bax以及凋亡蛋白家族如caspase-3，cleaved caspase-3之间的关系。验证LY294002抑制剂阻断PI3K/Akt通路后，对MV相关作用的影响。①将浓度为20μg/mL的MV与PC12细胞分别共培养0，5min，10min，20min，30min，1h，12h，24h后收集细胞，提取蛋白，检测不同时间段MV对PC12细胞Akt磷酸化的影响;②将不同浓度的MV(0，1μg/mL，10μg/mL，20μg/mL)与PC12细胞共培养30min，观察不同浓度MV对细胞Akt磷酸化水平的影响;③将实验分为control组、Glu损伤组、Glu+MV组、Glu+LY组、Glu+MV+LY组，按规定共培养一定时间后，利用Western Blot技术检测不同组细胞Akt磷酸化水平;④实验分组并按规定时间培养后，观察MV对细胞Bcl-2、Bax以及caspase-3蛋白表达变化，并检测加入PI3K/Akt通路抑制剂LY294002后，对MV相关作用的影响。 [结果] 1.rBMSC分离提取与鉴定 利用密度梯度离心、早期贴壁分离以及胰酶消化相结合的方法，成功从大鼠胫骨、股骨分离出形态均一的骨髓MSCs，细胞呈典型长梭形，流式结果显示细胞表面标记CD31、CD34、CD45为阴性，CD29、CD44为阳性;体外诱导结果显示提取细胞可向脂肪和成骨细胞分化。 2.rBMSC-MV提取鉴定 经低温超速离心法成功提取出rBMSC-MV，电镜观察显示膜微囊为直径30-200nm的圆形囊状结构;流式细胞术鉴定结果显示rBMSC-MV表面标记物与rBMSC相似，即CD31、CD34、CD45为阴性，CD29、CD44为阳性，说明了MV的细胞来源。 3.谷氨酸损伤模型的建立 观察不同浓度谷氨酸作用于PC12细胞不同时间后，对细胞活性以及乳酸脱氢酶(LDH)释放率的影响。结果显示，谷氨酸对PC12细胞活性及细胞膜的破坏作用具有时间和剂量依赖性。随作用时间的推移以及作用浓度的增加，PC12细胞活性下降，膜破坏程度增加。与对照组相比，5mmol/L、10mmol/L谷氨酸浓度对细胞活率具有明显的抑制作用，差异具有统计学意义。LDH检测试剂盒检测谷氨酸对细胞膜通透性的影响，结果显示，随作用时间以及作用浓度的增加，细胞膜通透性逐渐增加，与对照组相比，5mmol/L、10mmol/L谷氨酸浓度对膜通透性的影响明显，差异具有统计学意义。根据上述初步实验结果，我们选取5mmol/L谷氨酸浓度、作用48h，建立谷氨酸损伤模型，该条件即对细胞有一定程度的损伤又不引起细胞大部分死亡，以完成后续实验。 4.不同浓度膜微囊对谷氨酸致细胞损伤的保护作用 ①采用MTT法检测rBMSC-MV作用后损伤细胞的活性变化情况，结果示，rBMSC-MV能够减少谷氨酸所致细胞活性减低，且与MV作用浓度具有剂量依赖性。与损伤模型组相比，10μg/mL、20μg/mL MV均能有效减少谷氨酸致PC12细胞损伤所致的细胞活性受损，差异具有统计学意义。②采用乳酸脱氢酶检测试剂盒检测上清中的LDH含量，结果显示，与损伤组相比，10μg/mL、20μg/mL的rBMSC-MV均能有效减少谷氨酸致PC12细胞损伤所致的LDH释放量，差异具有统计学意义。③不同浓度rBMSC-MV对谷氨酸致PC12细胞凋亡的影响:采用Annexin-Ⅴ/PI凋亡检测试剂盒对各组细胞凋亡率进行检测，结果显示不同浓度MV对损伤细胞均有一定程度的保护作用。与损伤组相比，10μg/mL、20μg/mL的MV均能减少细胞凋亡，差异具有统计学意义。 5.PI3K/Akt信号通路介导BMSC-MV的保护作用 通过免疫印迹方法验证MV与PI3K/Akt信号通路，MV与Bcl-2、Bax以及凋亡蛋白家族如caspase-3、cleaved caspase-3之间的关系，并进一步验证LY294002抑制剂阻断PI3K/Akt通路后，对上述MV相关作用的影响。结果显示:①随着时间的延长，MV能不同程度激活PI3K/Akt通路，使Akt磷酸化。到30min时，Akt磷酸化程度达到峰值，随后，随作用时间的延长，Akt磷酸化程度逐渐下降。共培养24h后，MV组Akt磷酸化程度仍比对照组高，但两者相比差异无统计学意义;②随作用MV浓度的增加，PC12细胞Akt磷酸化水平逐渐增加，具有剂量依赖性。与对照组，10μg/mL、20μg/mL MV组Akt磷酸化程度明显，差异具有统计学意义;③MV对谷氨酸致PC12细胞损伤组细胞Akt磷酸化的影响。结果显示:谷氨酸能够降低Akt磷酸化水平，加入MV后，Akt磷酸化水平较损伤模型组增加，差异具有统计学意义。加入PI3K/Akt通路抑制剂LY294002后，MV所致Akt磷酸化水平被大部分抑制，与损伤组相比无显著性差异;④MV对损伤细胞Bcl-2、Bax以及凋亡蛋白家族caspase-3蛋白表达水平的影响。结果显示:与损伤细胞组相比，加入MV组能够明显的增加Bcl-2蛋白表达水平，降低Bax，caspase-3凋亡蛋白表达水平，差异具有统计学意义。加入PI3K/Akt通路抑制剂LY294002后，MV所致Bcl-2、Bax以及caspase-3蛋白表达变化被削弱，与损伤组相比，无显著性差异。 [结论] 通过以上实验我们初步证实了(1) rBMSC-MV具有一定的促PC12细胞增殖的作用;(2) rBMSC-MV能够减轻谷氨酸致PC12细胞损伤程度，减少细胞凋亡;(3)通过免疫印迹方法验证了MV通过激活PI3K/Akt信号通路，增加Bcl-2蛋白表达量，减少Bax、凋亡蛋白caspase-3表达量，减轻谷氨酸所致PC12细胞的损伤、凋亡级联反应，从而保护细胞，减轻损伤。一定程度上说明rBMSC-MV对神经损伤的保护与修复作用。

目录

摘要

前言

第一章 BMSC及BMSC-MV分离、提取与鉴定

1．1 引言

1．2 材料和方法

1．3 结果

1．4 讨论

1．5 小结

第二章 谷氨酸损伤PC12细胞模型的建立

2．1 引言

2．2 材料和方法

2．3 结果

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 PI3K／Akt介导BMSC-MV对损伤细胞的保护

3．1 引言

3．2 材料和方法

3．3 结果

3．4 讨论

3．5 小结

技术路线图

全文总结

参考文献

英文缩略词表

硕士在读期间发表论文情况

致谢

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