悬浮芯片技术检测腹泻病原体和MALDI--TOF MS鉴定腹泻病原菌的临床应用评估

摘要

研究背景及目的: 腹泻，即每日排便3次或以上，同时伴有大便性状异常。腹泻发病率居高不下，一直是世界重要公共卫生负担之一。特别是婴幼儿，不仅发病率高，而且是其死亡的主要原因之一。细菌、病毒和寄生虫均可引起腹泻，其中致病性明确的病原体有沙门菌、志贺菌、弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森菌、假结核耶尔森菌、气单胞菌、类志贺邻单胞菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、拟态弧菌、河流弧菌、致泻性大肠杆菌、轮状病毒、腺病毒40/41型、诺如病毒GⅠ/GⅡ型、星状病毒、札如病毒、溶组织阿米巴、蓝氏贾第鞭毛虫和隐孢子虫。 不同病原体感染导致的腹泻症状大同小异，腹泻病因诊断依赖实验室检查，因此，快速且准确的腹泻病原体检测方法对早期诊断腹泻病因非常重要。 临床实验室诊断腹泻主要依赖于病原菌选择性培养及鉴定、病毒抗原检测、寄生虫镜检，存在灵敏度低且费时费力等缺点。实时荧光PCR检测腹泻病原体，虽然大大地提高了检测灵敏度和特异性，但多重检测能力有限，不能满足临床快速且准确诊断腹泻病因的要求。由于腹泻病原体常规检测方法本身存在不足之处，且病原体检测不全面，大部分腹泻患者的腹泻病因未能明确。临床诊断实验室急需寻找快速且准确的腹泻病原体检测新方法。 几十年来，临床常规腹泻病原菌鉴定方法主要依赖生化和血清学鉴定，不仅操作繁琐、耗时，且需要大量生物学材料。此外，基于生化试验的腹泻病原菌种水平鉴定结果尚不能做到完全准确。临床实验室急需寻找快速且准确的腹泻病原菌鉴定新方法。 现代临床微生物实验室发展的迫切需要体现如下:快速检测与报告结果的时效性，检验流程标准化，加强与临床紧密沟通。近几年，为适应临床需要，许多临床应用检验诊断技术的研发均以快速、高通量检测为首要目的，其中成果较为突出、临床应用前景较为广阔的是悬浮芯片技术和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术。 悬浮芯片技术是唯一被美国食品与药物管理局批准用于临床诊断的新型生物芯片产品。该技术作为一种新型、高通量的生物芯片技术，将流式细胞术、激光技术及应用流体学等技术结合在一起，利用悬浮在液相中的分类荧光编码微球作为检测载体，具有高通量、速度快、灵敏度高、重复性好、特异性强、多重检测等特点。在临床上，悬浮芯片技术可用于各种呼吸道病毒、手足口病毒、致病菌和遗传病的基因检测，以及抗原抗体定性定量检测、细胞因子检测和激素水平检测。当前，国外已研发成功了一系列商品化检测试剂盒并应用于临床诊断。基于悬浮芯片技术研发的xTAG Gastrointestinal Pathogen Panel(xTAG GPP)是Luminex公司于2011年推出的腹泻病原体基因检测试剂盒。该试剂盒于2013年获得FDA批准，在国内外临床诊断实验室的应用处于初步探索阶段，国内尚未见到有关其临床应用的报道。 MALDI-TOF MS作为一种新的微生物鉴定方法，基于细菌的蛋白质指纹图谱的特征峰谱进行鉴定，打破了常规鉴定方法操作繁琐且耗时的特点，极大地简化了鉴定流程，鉴定过程自动化。在临床诊断实验室，MALDI-TOF MS用于临床分离细菌和真菌鉴定，不仅缩短了鉴定时长，同时具有较高的鉴定正确率。由于仪器昂贵，一次性投入成本高，MALDI-TOF MS在国外临床微生物实验室的应用尚未普及，在国内临床微生物检验中的应用刚刚起步。MALDI-TOF MS用于细菌鉴定，具有操作简便、自动化、快速、高通量及检测范围广等优势，随着该鉴定技术的不断发展和在临床微生物实验室的推广应用，将取代或改变现在临床微生物实验室的工作模式或流程，使微生物的检测更加简易、快速，检验结果报告更加及时，检验流程更加标准，因此，引进MALDI-TOF MS对临床微生物实验室的现代化发展具有重要影响。据了解，广州地区已有两家医院引进了该技术并用于临床分离菌株日常鉴定。自2008年商品化以来，国外有关应用MALDI-TOF MS鉴定常见临床分离菌株的研究越来越多，但鉴定腹泻病原菌的应用报道很少且研究涵盖的腹泻病原菌种类有限，MALDI-TOF MS鉴定少见的腹泻病原菌的临床应用价值有待评估。 本研究着重于对基于悬浮芯片技术研发的商品化试剂盒xTAG GPP在腹泻病因诊断和MALDI-TOF MS在腹泻病原菌鉴定的表现进行评价，为技术的临床应用提供依据和更好地为临床服务。 第一章 Luminex xTAG GPP检测腹泻病原体的临床应用评估 为了评估Luminex xTAG GPP检测腹泻病原体的临床应用可行性，我们收集2012年11月至2013年5月因腹泻到珠江医院就诊的患者的粪便样本，采用临床常规检测方法筛查18种致病性明确的腹泻病原体:13种细菌（沙门菌、志贺菌、弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森菌、假结核耶尔森菌、气单胞菌、类志贺邻单胞菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、拟态弧菌、河流弧菌、大肠杆菌O157、产热不稳定性肠毒素大肠杆菌）、3种病毒（轮状病毒、腺病毒40/41，诺如病毒GⅠ/GⅡ）和2种寄生虫（溶组织阿米巴、蓝氏贾第鞭毛虫），初步了解广州地区腹泻病原谱构成;收集的粪便样本进行xTAG GPP检测，评价xTAG GPP与常规检测方法检测12种腹泻病原体（沙门菌、志贺菌、弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森菌、大肠杆菌O157、产肠毒素大肠杆菌、霍乱弧菌、轮状病毒、诺如病毒GⅠ/GⅡ型、腺病毒40/41型、溶组织阿米巴、蓝氏贾第鞭毛虫）的吻合度;将xTAG GPP检测结果与常规方法检测结果不一致的样本进行PCR扩增和测序分析;收集的粪便样本进行艰难梭菌毒素A和毒素B基因PCR扩增和测序分析，比较xTAG GPP与基因序列分析检测艰难梭菌毒素A/B的吻合度，从而更加全面地评价xTAG GPP检测腹泻病原体的准确性。 共收集腹泻粪便样本290份，分别来自290例腹泻患者，患者男女比186∶104，年龄11天至83岁不等，中位年龄25个月。住院患者70例，门诊患者220例，大部分为儿科门诊患者，占所有患者的54.14％。 临床常规检测方法检测阳性的样本有159份，其中单一病原体检测阳性样本137份，双重感染22份，共检出69个腹泻病原菌和112个病毒。18种腹泻病原体中，轮状病毒的检出率最高，阳性率为21.38％(62/290)，其次为诺如病毒GⅠ/GⅡ型，阳性率为15.52％(45/290)，沙门菌、弯曲菌、气单胞菌、腺病毒40/41型的阳性率分别为10.34％(30/290)、6.90％(20/290)、3.45％(10/290)、1.72％(5/290)，志贺菌和类志贺邻单胞菌的阳性率均为1.03％(3/290)，小肠结肠炎耶尔森菌、大肠杆菌O157和产肠毒素大肠杆菌的阳性率均为0.35％（1/290、1/290和1/290），霍乱弧菌、副溶血性弧菌、拟态弧菌、河流弧菌、假结核耶尔森菌、溶组织阿米巴和蓝氏贾第鞭毛虫均未检出。 xTAG GPP不能检测可用常规方法检测的副溶血性弧菌、拟态弧菌、河流弧菌、假结核耶尔森菌;因未用常规检测方法检测xTAG GPP可检测的产志贺毒素样大肠杆菌、艰难梭菌和隐孢子虫，故暂不做比较。xTAG GPP检测12种腹泻病原体的结果与常规检测方法的吻合度较强（κ=0.860，P=0.000）。其中，xTAG GPP与常规检测方法检测小肠结肠炎耶尔森菌、诺如病毒GⅠ型、霍乱弧菌、蓝氏贾第鞭毛虫的结果完全一致;检测结果吻合度较强的检测项目有轮状病毒（κ=0.930，P=0.000）、诺如病毒GⅡ型（κ=0.927.，P=0.000）、志贺菌(κ=0.855，P=0.000)、沙门菌（κ=0.798，P=0.000）和腺病毒40/41型（κ=0.747，P=0.000）;吻合度一般的检测项目有弯曲菌（κ=0.686，P=0.000）、大肠杆菌O157(κ=0.497，P=0.000);吻合度较差的检测项目为产肠毒素大肠杆菌（κ=0.329，P=0.000）。xTAG GPP与常规检测方法检测溶组织阿米巴不一致的结果仅一个，溶组织阿米巴的阳性率太低，不能进行两种检测方法吻合度的统计学分析。 xTAG GPP与常规检测方法检测12种腹泻病原体的结果不一致的样本有42份，共产生49个不一致的结果。仅常规检测方法阳性的有10个，仅xTAG GPP检测阳性的有39个。48个不一致的结果经基因序列分析，常规检测方法与基因序列分析结果一致的有12个，来源于12份样本，分别为培养阳性而xTAGGPP检测阴性的5个沙门菌，培养阴性而xTAG GPP检测阳性的3个沙门菌和1个志贺菌，实时荧光PCR检测阴性而xTAG GPP检测阳性的3个诺如病毒GⅡ型;xTAG GPP与基因序列分析结果一致的有36个，来源于30份样本，分别为xTAG GPP检测阳性而培养阴性的3个沙门菌、16个弯曲菌，2个大肠杆菌O157、4个产肠毒素大肠杆菌，xTAG GPP检测阳性而免疫层析法检测阴性的6个轮状病毒和xTAG GPP检测阴性而免疫层析法检测阳性的1个轮状病毒和2个腺病毒40/41型，xTAG GPP检测阴性而实时荧光PCR检测阳性的2个诺如病毒GⅡ型。 常规检测方法检测的共感染样本有22份，为双重感染，占所有阳性样本的13.84％，共感染组合形式有15种，以轮状病毒合并诺如病毒感染最常见(4/22，18.2％)。xTAG GPP检测的共感染样本有24份，共感染组合形式有17种，其中，双重感染有20份，三重感染有4份，以弯曲菌合并诺如病毒感染最常见，共4份，占全部共感染样本的16.7％。 290份粪便样本中，xTAG GPP检测艰难梭菌毒素A/B的阳性率为13.45％(39/290)，基因序列分析检测的阳性率为15.17％(44/290)，两者的检测结果吻合度较高(κ=0.946，P=0.000)。 第二章 MALDI-TOF MS鉴定腹泻病原菌的临床应用评估 为了对MALDI-TOF MS鉴定腹泻病原菌的临床应用价值进行评估，我们将冻存的10株腹泻病原菌标准株和73株临床分离腹泻病原菌（共8属）复苏后，挑取新鲜菌落进行MALDI-TOF MS鉴定和细菌基因序列分析，以基因序列分析的结果为参考，分析MALDI-TOF MS在种水平和属水平鉴定常见腹泻病原菌的准确性;10株气单胞菌和6株沙门菌分别进行MALDI-TOF MS和细菌生化鉴定系统Vitek2鉴定，并记录MALDI-TOF MS和Vitek2鉴定16株细菌从样品制备到获取鉴定结果所需的时间和耗材成本，比较MALDI-TOF MS与Vitek2在种水平和属水平鉴定气单胞菌和沙门菌的结果、耗材成本以及完成鉴定所需的时间。 大肠杆菌和志贺菌的遗传背景相近，两者的质谱图非常相似，正如MALDI-TOF MS微生物鉴定系统提示，MALDI-TOF MS不能区分大肠杆菌和志贺菌，3株志贺菌标准株和3株临床分离志贺菌的鉴定结果均报告为大肠杆菌。MALDI-TOF MS对其它7株（共5属7种）腹泻病原菌标准株和70株(6属)临床分离腹泻病原菌均正确鉴定到属，分别是:沙门菌属、弯曲菌属、气单胞菌属、耶尔森菌属、弧菌属、邻单胞菌属和梭状芽孢杆菌属。除沙门菌和气单胞菌，15株空肠弯曲菌、6株结肠弯曲菌、3株类志贺邻单胞菌、3株小肠结肠炎耶尔森菌、2株艰难梭菌、1株副溶血性弧菌、1株河流弧菌和1株霍乱弧菌减毒株，MALDI-TOF MS鉴定至种水平的鉴定结果完全正确。 MALDI-TOF MS和Vitek2不能区分嗜水气单胞菌和豚鼠气单胞菌，鉴定结果显示为嗜水/豚鼠气单胞菌。因嗜水气单胞菌和豚鼠气单胞菌的质谱图非常相似，MALDI-TOF MS的分辨力不足以区分，但可以根据葡萄糖产气反应区分两者;而基于细菌生化反应特征进行鉴定的Vitek2仪器则不能检测产气反应，因此不能区分两者。MALDI-TOF MS在种水平鉴定10株气单胞菌的结果与Vitek2鉴定结果基本

目录

摘要

前言

第一章 Luminex xTAG GPP检测腹泻病原体的临床应用评估

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第二章 MALDI-TOF MS鉴定腹泻病原菌的临床应用评估

1 材料与方法

3 结果

3 讨论

全文小结

参考文献

综述 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱在临床微生物实验室检测微生物的应用进展

缩略词简表

致谢

硕士研究生期间发表论文

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