EBV--miR--BART7--3p对鼻咽癌增殖的影响及其作为潜在治疗靶点的研究

摘要

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是指发生于鼻咽粘膜的恶性肿瘤，多发于中年人，偶见青少年，恶性程度高，早期即可出现颈部淋巴结转移，常高发于中国的华南地区和东南亚等地，具有明显地域性。治疗鼻咽癌的主要手段是放疗和化疗，尽管当前治疗水平有了很大的提高，但鼻咽癌5年生存率仍然只有50％左右，因此目前亟待开发更多的治疗方法，能够辅助放化疗进一步提高鼻咽癌患者的生存率。 虽然鼻咽癌的发病机制尚未明确，但有研究表明鼻咽癌的发生发展与EB病毒(EBV)的感染有关。EB病毒是一种特异性嗜淋巴细胞性疱疹病毒，90％以上的成人体内可检出该病毒的感染。因此，对EBV的深入认识是目前研究鼻咽癌不可或缺的方向之一，对EBV的研究有可能成为寻找鼻咽癌早期诊断、治疗新方法和判断预后的突破点。非编码微小RNA（microRNA）是一类重要的基因表达调控因子，可在转录后水平或翻译水平调节基因表达，参与肿瘤细胞的侵袭、转移和肿瘤血管形成等生物学过程，而EBV是第一个被发现能编码miRNA的病毒。Pfeffer等在2004年首次从EBV中分离出小RNA属人疱疹病毒家族成员，研究表明其在病毒感染宿主过程中发挥重要作用，这些miRNAs分别被命名为 EBV-miR-BHRF1-1、EBV-miR-BHRF1-2、EBV-miR-BHRF1-3、EBV-miR-BART1和EBV-miR-BART2，这是最早发现的EB病毒编码的miRNA分子。随后一年，Pfeffer等人经过计算分析与实验研究又从29种病毒中识别出33条病毒miRNA。Pfeffer等人的发现使病毒miRNA研究成为一个新的研究热点，开辟了新的研究领域分支，为病毒miRNA分子调控宿主基因表达和病毒自身基因表达提供了新的研究方向，也向病毒与宿主细胞间相互作用新模式研究迈出了重要的一步。目前，人们所鉴定出的能编码miRNA的病毒绝大多数属致瘤病毒，由此可见EBV编码的miRNA可能与鼻咽癌的发生发展密切相关。然而，迄今为止人们也只是发现了部分EBV编码miRNA的功能:如EBV-miR-BHRF具有与抑癌基因P53结合的潜在位点;EBV-miR-BART2编码的核酸可以完全互补于DNA聚合酶BALF5的3' UTR区域，因此可以预测BALF5是EBV-miR-BART2的靶基因之一;EBV-miR-BART5的靶分子PUMA（凋亡前蛋白）可以介导P53引起细胞凋亡;EBV-miR-BHRF1-1能参与TPA介导的EBV裂解蛋白质的积聚和病毒裂解周期后期的病毒复制。这些EBV编码的miRNA能直接或者间接通过某一信号通路调节靶基因，促进或抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移和肿瘤血管形成等，所以明确这些miRNAs过表达或缺失所产生的生物学功能，有利于我们反向调节靶基因，取得基因治疗效果。 近年来，国内外已经有不少学者在鼻咽癌基因治疗研究方面做了许多有益的探索和研究，并取得可喜的成果。Moolten首次提出用单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因转移联合丙氧鸟苷(GCV)治疗恶性肿瘤。Li等人向EBV表达活跃的鼻咽癌细胞C666-1注射腺病毒转导的p16基因，能提高其阳性表达率，抑制癌细胞增殖。EBV编码的很多miRNAs可以通过某一信号通路调控其靶基因促进或抑制肿瘤发生发展，如某些miRNA的过表达可以激活致癌基因，促进肿瘤细胞的增殖。因此，发展与miRNA相关的药物，对EBV编码的miRNA进行调节，对实现鼻咽癌基因治疗具有很大的市场潜力和临床价值。所谓基因治疗就是通过基因载体将目的基因传递到特定的组织细胞（靶细胞）内进行适当表达而达到治疗目的，因而构建一个成功的基因载体就显得尤为重要。目前基因载体主要分为病毒载体和非病毒载体，病毒载体主要包括逆转录病毒（retrovirus）、腺病毒(adenovirus)、腺相关病毒(adeno-associatedvirus)、简单疱疹病毒（herpessimplexvirus）及慢病毒(lentivirus)等，具有较高的转染效率。虽然病毒载体的基因转染效率高，但也存在严重的缺陷，如制备条件复杂、基因携带能力有限、具有免疫原性，还有潜在的致癌作用，细胞毒性大，限制了其在人体内的应用。非病毒载体的转染效率要比病毒载体低，但合成简便、储存稳定、目的基因容量大、免疫原性低，应用广泛，主要包括有脂质体、阳离子聚合物和纳米颗粒等。其中纳米颗粒具有小尺寸效应、表面效应等优势，可以包裹、浓缩、保护核苷酸，使其免受核酸酶降解;通过表面功能化，连接特异靶向分子以及体内循环时间明显长于普通大小颗粒等优点，作为基因载体倍受青睐。刘海等人利用纳米脂质体将野生型p53基因转导入细胞内，细胞表达p53蛋白后具有明显的诱导鼻咽癌细胞产生凋亡效应，这种与纳米技术结合的方法高效、低毒和无免疫排斥反应，目前在基因治疗领域被认为是最具临床前景的。因而将纳米技术与医学结合，构建纳米基因载体，设计纳米基因分子药物是一个值得深入研究的方向。 纳米金是一种惰性物质，其粒径介乎1nm～100nm之间，制备方法简单，具有良好的生物相容性和表面易于功能化等特点，是优良的药物输送载体。聚乙烯亚胺(PEI)是迄今为止转染效率最高的阳离子聚合物之一，当前已有近千篇关于PEI及其衍生物、修饰物作为基因药物载体的研究报告。PEI富含氨基，具有“质子海绵效应”，能够保护DNA免受核酸酶降解，促进与细胞的结合和摄取，完成转染。然而PEI随着分子量的增大转染效率升高，但细胞毒性也会增加，因此目前大多数的研究都是在不影响PEI转染效率的前提下，对其结构进行适当修饰降低其细胞毒性。PEI单独使用的时毒性较大，而纳米金颗粒外形呈球形，生物相容性好，表比面积极大，表面可以负载很多的低分子PEI，提高其转染效率的同时，还能降低它的毒性作用。结合纳米金与PEI的优点，我们探索采用层层包裹的方法，制备以金颗粒为核，外层包裹低分子量聚乙烯亚胺，制备纳米金-聚乙烯亚胺基因载体。 目前大多数关于EB病毒miRNA的研究仍局限于其表达谱分析和部分靶基因鉴定及初步功能分析，涉及的更多的是机制研究。在功能研究方面，多数研究者都集中在鼻咽癌发生发展过程中，某些EBV-miR-RNA的上调或下调所产生的生物功能变化，如促进肿瘤增殖，凋亡，侵袭、转移等生物过程。然而针对某一EBV-miR-RNA功能深入研究并对其进行基因疗法的研究较为少有，因此我们通过一系列体外体内实验去鉴定某一EB病毒miRNA的功能后，然后针对这一EB病毒miRNA的功能，结合纳米技术的优势，研发纳米基因药物，进行基因治疗，从基因层面解决问题，这是一个值得探索的新课题。 1.EBV-miR-BART7-3p对鼻咽癌增殖的影响 我们首先进行鼻咽癌临床组织样本分析，探讨EBV-miR-BART7-3p在鼻咽癌发生发展中的潜在作用，应用探针法Taqman Real-time PCR检测另外收集的40例TMN分期明确的鼻咽癌组织，证实EBV-miR-BART7-3p在T1到T4期鼻咽癌患者组织中表达均显著上调，而相比T1、T2，T3、T4期上调更为明显(t=5.553;P＜0.001)，可见其与鼻咽癌增殖发展密切相关。为进一步验证临床分析数据，研究EBV-miR-BART7-3p在鼻咽癌增殖中的潜在作用，我们采用了慢病毒过表达miRNA与miRNA inhibitor沉默miRNAs策略，将表达EBV-miR-BART7-3p前体（pre-EBV-miR-BART7-3p）的慢病毒分别感染EBV阴性的鼻咽癌细胞株CNE1、5-8F，构建EBV-miR-BART7-3p稳定过表达的鼻咽癌细胞株CNE1-BART7-3p、5-8F-BART7-3p，分析EBV-miR-BART7-3p过表达对鼻咽癌细胞生物学行为的影响。MTT比色实验提示过表达EBV-miR-BART7-3p后，CNE1-BART7-3p和5-8F-BART7-3p细胞体外增殖能力增强，而通过EBV-miR-BART7-3p inhibitor将EBV-miR-BART7-3p沉默后，CNE1-BART7-3p和5-8F-BART7-3p细胞体外增殖能力明显下降。平板克隆形成实验检测EBV-miR-BART7-3p过表达对鼻咽癌细胞克隆形成能力的影响，结果发现EBV-miR-BART7-3p过表达使CNE1细胞和5-8F细胞的克隆形成率明显增高，干扰EBV-miR-BART7-3p后克隆形成率下降。同样，流式细胞仪分析细胞周期提示EBV-miR-BART7-3p过表达可以促进鼻咽癌细胞进入增殖期而提高细胞的体外增殖能力，而对其进行干扰后则抑制了细胞体外增殖能力。裸鼠皮下成瘤实验提示EBV-miR-BART7-3p可以促进鼻咽癌细胞的增殖能力。以上研究结果表明，EBV-miR-BART7-3p参与了鼻咽癌的发生发展，能促进鼻咽癌细胞的体外增殖与体内成瘤能力。 2.纳米金-聚乙烯亚胺基因载体的构建及其介导EBV-miR-BART7-3p反义寡核苷酸纳米基因药物体外功能实验 近年来基因疗法治疗癌症得到了很大的突破，基因载体的构建极为重要。在本研究中，我们采用层层包裹技术制备基因载体，首先通过柠檬酸钠还原法制备纳米金颗粒后，再应用11-巯基十一烷酸对金颗粒进行修饰，使其表面带有羧基，然后进一步将带有氨基的低分子量聚乙烯亚胺与羧基进行连接。并应用用动态光散射(DLS)，紫外可见光谱(UV)和透射电子显微镜(TEM)对所构建的纳米金-聚乙烯亚胺基因载体进行表征。结果提示我们成功制备了聚乙烯亚胺-纳米金基因载体，检测表明每一步制备出的产物纳米尺寸在20-30 nm之间，液体均匀稳定，分散系数(PDI)在0.2以下，Zeta电位测定表明，每步的产物电荷变化与外层包裹的反应物相关。尽管金颗粒外层包裹聚乙烯亚胺，但是总体上纳米载体尺寸没有发生太大的变化，TEM检测亦表明每一步形成了均匀的、单分散的、球状的纳米颗粒。成功制备载体以后，我们测试了该载体在无血清BSA，1％BSA，10％BSA，Opt-Mem等不同媒介中的粒径、电位及紫外光吸收峰变化，观察其在不同的媒介中的稳定性，摸索最佳转染条件。实验结果表明纳米金-聚乙烯亚胺基因载体在转染实验前6h在Opt-Mem媒介中适合转染，Opt-Mem媒介为最佳转染培基。在上述研究基础上，再进一步开展纳米金-聚乙烯亚胺基因载体和与Lip2000脂质体的Cellular uptake实验和鼻咽癌EBV-miR-BART7-3p反义寡核苷酸的基因沉默实验。结果提示，我们所制备的纳米金-聚乙烯亚胺基因载体转染效果要优于Lip2000脂质体，其中纳米金-聚乙烯亚胺基因载体和与Lip2000脂质体鼻咽癌EBV-miR-BART7-3p反义寡核苷酸基因沉默实验表明，该载体在转染实验前三天的转染效果最优，这为下一步构建鼻咽癌裸鼠动物模型进行局部治疗实验的给药时间提供了主要依据。 3.纳米金-聚乙烯亚胺介导EBV-miR-BART7-3p反义寡核苷酸纳米基因药物的体内外实验 EBV-miR-BART7-3p参与了鼻咽癌的发生发展，能促进鼻咽癌细胞的体外增殖与体内成瘤能力。而我们制备的基因载体也具有极高的转染效率。结合两个结论，我们开始选择最适合构建构建裸鼠人鼻咽癌动物模型的细胞株以进行局部治疗实验，通过探针法荧光定量PCR，我们分析了CNE1-BART7-3p、5-8F-BART7-3p、C661-1/EBV、HK1-EBV、HONE1/EBV和人鼻咽癌组织EBV-miR-BART7-3p的表达量，结果发现HONE1/EBV中EBV-miR-BART7-3p与人鼻咽癌组织标本中EBV-miR-BART7-3p的表达量最为接近。鉴于此，我们使用HONE1/EBV细胞株构建了鼻咽癌人裸鼠动物模型，利用纳米金-聚乙烯亚胺基因载体介导EBV-miR-BART7-3p反义寡核苷酸进行了裸鼠人鼻咽

目录

摘要

前言

参考文献

第一章 EBV-miR-BART7-3p对鼻咽癌增殖的影响

1 试剂和仪器

2 实验方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第二章 纳米金-聚乙烯亚胺基因载体的构建及其介导EBV-miR-BART7-3p反义寡核苷酸纳米基因药物的体外功能实验

1 试剂和仪器

2 实验方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第三章 纳米金-聚乙烯亚胺介导EBV-miR-BART7-3p反义寡核苷酸纳米基因药物的体内外实验

1 试剂和仪器

2 实验方法

3 结果

4 讨论

全文小结

攻读学位期间成果

英文缩写注解

致谢

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