miR-199靶向调控ROCK1影响肾癌细胞增殖、侵袭及凋亡的机制研究

摘要

目的:
　　1.探讨miR-199a在肾癌及癌旁相对正常组织中的表达，分析其表达与肾癌患者预后的关系;
　　2.探讨miR-199a在肾癌中的表达对细胞增殖、侵袭及凋亡的影响;
　　3.探讨miR-199a与其下游靶基因及上游调控基因的作用关系，阐明miR-199在肾癌中的作用机制;
　　方法:
　　1.采用qRT-PCR定量检测miR-199a在39例肾癌患者肿瘤组织及其癌旁相对正常肾组织中的表达量，并分析miR-199a在肾癌中的表达与患者预后的关系。
　　2.采用慢病毒感染的方法，构建稳定过表达miR-199a的A498细胞株和空载对照组细胞株，并采用qRT-PCR进行验证。
　　3.采用MTT实验、平板克隆实验检测肾癌细胞的增殖情况;应用Transwell试验检测细胞的侵袭能力;利用流式细胞仪检测肾癌细胞的凋亡情况。
　　4.通过靶基因预测网站，结合生物信息学分析筛选miR-199a下游的候选靶基因，明确ROCK1可作为miR-199a的直接靶基因。通过构建ROCK1突变体，将ROCK1与miR-199a共转染肾癌A498细胞株，采用荧光素酶报告实验检测miR-199a对野生型及突变型ROCK1荧光素活性的影响，探讨其作用关系。并采用MTT实验、平板克隆实验检测ROCK1与miR-199a共转染对肾癌细胞增殖能力的影响，采用流式细胞仪检测ROCK1与miR-199a共转染对肾癌细胞凋亡能力的影响。此外，通过qRT-PCR检测ROCK1在39例肾癌组织中的表达，分析其表达与miR-199a表达的临床相关性。
　　5.通过分析miR-199a的DNA编码序列，结合生物信息学分析，寻找其上游调控基因，发现在miR-199的DNA序列中有一个Snail转录子的结合位点，初步预判Snail为miR-199的上游调控基因。通过基因克隆，获得miR-199a上游Snail启动子结合位点，再将Snail启动子结合位点及miR-199a共同转染A498细胞株，通过荧光素酶报告实验检测Snail与miR-199的荧光素活性，并结合Northern blot实验进一步验证Snail与miR-199a之间的作用关系。同时，采用qRT-PCR检测Snail在39例肾癌组织中的表达，分析其表达与miR-199a表达的临床相关性。
　　结果:
　　1.miR-199a在肾癌组织中的表达及其意义
　　首先我们检测了RNA提取的纯度，经1％琼脂糖凝胶电泳后，可见28S、18S、5S三条清晰的带型，未见DNA条带，表明所抽提的RNA无降解、无DNA污染，相对较纯，可用于逆转录及后续实验。
　　随后，以U6作为内参，采用qRT-PCR检测了miR-199a在肾癌病变及癌旁组织中的表达。荧光定量PCR溶解曲线显示miR-199a及U6引物特异性高，无非特异性扩增和引物二聚体干扰，结果表明miR-199a低表达于肾癌组织，与配对的癌旁组织相比，平均下调2-4倍，差异显著，有统计学意义(P＜0.01)。
　　结合患者的相关资料，我们分析了miR-199a表达与患者预后的关系。结果显示miR-199a下调病人平均生存时间为（41.147±8.713）个月，中位生存时间为34.4个月，miR-199a上调患者平均生存时间为（71.377±7.125）个月，中位生存时间分别为70.1个月。miR-199a低表达患者的1年及3年生存率分别为83.4％、14.7％;miR-199a高表达患者1年及3年生存率分别为93.2％、48.7％，二者差异显著，具有统计学意义(P＜0.01)。经COX多因素分析，结果显示在排除肿瘤大小、TNM分期、临床分期等因素的影响后，miR-199a低表达可作为肿瘤特异性死亡的危险因素(RR=1.714，95％CI:1.127-2.216，P=0.03)。
　　2.miR-199a通过调控靶基因ROCK-1影响肾癌细胞的增殖、侵袭及凋亡
　　为明确miR-199a可能调控的靶基因，我们选择了3个预测软件预测结果的交集作为miR-199a的候选靶基因。结果表明ROCK1的mRNA序列中存在着miR-199a的一段互补序列，即结合位点。因此，我们认为ROCK1可能为miR-199a下游调控的直接靶基因之一。
　　为了验证ROCK1是否为miR-199a的直接靶基因，我们构建了ROCK1野生型及突变型载体，并克隆形成荧光素酶载体，将其与空载对照载体分别与miR-199共转染肾癌A498细胞株。结果表明miR-199a明显抑制野生型ROCK1的表达（P＜0.05），却不能影响突变型ROCK1表达。同时，我们采用qRT-PCR及Western blot检测野生型ROCK1在miR-199a过表达细胞株中的表达情况，结果均显示miR-199a过表达后，ROCK1表达明显减低(P＜0.01)。
　　miR-199a过表达后，细胞的克隆数明显低于对照组，同时明显低于miR-199a与ROCK-1共转染组，提示miR-199a表达能明显抑制肾癌细胞的增殖。
　　为探讨miR-199a调控靶基因ROCK-1对肾癌细胞侵袭能力的影响，我们进行了Transwell侵袭实验，结果示miR-199a过表达后，细胞的侵袭数明显低于对照组及miR-199a与ROCK-1共转染组，但是恢复ROCK-1的表达能部分抑制miR-199所引起的侵袭抑制作用(P＜0.01)。
　　为探讨miR-199a调控靶基因ROCK-1对肾癌细胞凋亡能力的影响，我们又进行了流式细胞仪检测，结果提示miR-199a过表达后，细胞凋亡率明显增加，但ROCK-1过表达能部分抑制miR-199a过表达所引起的细胞凋亡。
　　3.miR-199a过表达及miR-199a/ROCK-1共表达对肾癌细胞体内生物学特性的影响
　　为了进一步明确miR-199a对肾癌细胞生长的影响，我们将miR-199过表达及空载对照慢病毒转染了肾癌A498细胞株，行裸鼠体内成瘤实验，结果表明miR-199a过表达肾癌细胞在裸鼠体内的生长明显受到抑制，形成的肿瘤重量明显低于空载对照组。
　　收集空载对照组(LV-ctrl)及miR-199a过表达实验组形成的肿瘤组织，采用免疫组化检测ROCK-1及增殖指标Ki-67的表达情况，结果显示ROCK-1在miR-199a过表达的实验组肿瘤中的表达明显低于对照组，Ki-67在miR-199a过表达的实验组肿瘤中的表达也明显低于对照组，提示miR-199a过表达后肿瘤的增殖及侵袭能力下降。
　　随后，我们也通过qRT-PCR定量检测了ROCK-1在39例肾癌组织中的表达，并分析了其表达与肾癌组织中miR-199表达的关系。结果表明ROCK-1高表达于肾癌组织，其表达与miR-199a表达呈明显的负相关（P＜0.01），相关系数为0.7665。
　　4.miR-199a上游调控因子的预测和鉴定
　　依据mRNA编码蛋白的原理，miRNA也是由其基因DNA转录而成，每一个miRNA的表达都是由一个启动子启动及转录因子调控。因此，我们查阅了相关基因的数据库，发现miR-199a基因序列中有一个Snail转录子的结合位点，初步判断Snail可能为miR-199a上游调控的候选基因。
　　随后，我们将miR-199a上的Snail启动子结合位点进行了克隆，命名为pGL3-miR-199a pro，并进行了荧光素酶报告实验，结果显示这个位点的区域也包含了miR-199a的初级转录物的启动子，并可以激发荧光素的表达。同时，我们将pGL3-miR-199a pro及空载分别与Snail进行共转染，发现pGL3-miR-199apro与Snail共转染后，荧光素表达活性明显降低。此外，qRT-PCR检测结果表明Snail过表达能抑制miR-199表达，Northern blot结果也显示Snail过表达能抑制miR-199a表达。为了进一步验证Snail与miR-199a的相关性，我们采用qRT-PCR定量检测了39例肾癌组织中Snail的表达，结果显示Snail高表达于肾癌组织，其表达与miR-199a呈负性相关关系，相关系数为0.6376(P＜0.05)。因此，这些结果提示Snail是miR-199a的上游调控基因。
　　结论:
　　1.miR-199a低表达肾癌组织，其高表达患者预后较好;
　　2.miR-199靶向调控下游基因ROCK-1，参与调控肾癌细胞的增殖、侵袭及凋亡;
　　3.Snail为miR-199a的上游调控基因;
　　本研究的创新之处
　　1.通过实验证实miR-199a低表达肾癌组织，其高表达患者预后较好;
　　2.首次揭示了miR-199a靶向调控下游基因ROCK-1，参与调控肾癌细胞的增殖、侵袭及凋亡;
　　3.首次明确了Snail可作为miR-199a的上游调控基因，进一步阐述了miR-199a在肾癌中的作用机制.

目录

摘要

前言

参考文献

第一章 miR-199a在肾癌组织中的表达及其意义

一、材料和方法

二、结果

三、讨论

参考文献

第二章 miR-199a调控靶基因ROCK-1影响肾癌细胞的增殖、侵袭及凋亡

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

参考文献

第三章 miR-199a过表达及miR-199a／ROCK1共表达对肾癌细胞体内生物学特性的影响

一、材料及方法

二、结果

三、讨论

参考文献

第四章 miR-199a上游调控因子的预测和鉴定

一、材料及方法

二、结果

三、讨论

参考文献

全文小结

综述 microRNA与肾癌的侵袭、转移

缩略语

攻读博士学位期间发表论文情况

攻读博士学位期间申请基金情况

致谢

声明

统计学审稿证明