胶质瘤中GLUT3基因异常表达的意义及其相关调控机制

摘要

本文从以下几部分进行论述：
　　第一部分:胶质瘤中GLUT3的表达及其意义
　　目的:
　　首先通过免疫组化技术检测不同级别胶质瘤标本中的GLUT3以及Ki-67表达情况，明确胶质瘤在演进过程中GLUT3表达量与肿瘤细胞增殖情况的关系。再用RNA干扰技术抑制胶质瘤中GLUT3表达，观察由此对胶质瘤细胞生长特性的改变。由此探明GLUT3在恶性胶质瘤中异常表达意义。
　　方法:
　　1)收集胶质瘤WHOⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级标本，每级5例。
　　2)用免疫组化方法检测标本中GLUT3、Ki-67蛋白的表达量
　　3)统计方法:应用SPSS17.0软件进行统计分析。标本中GLUT3(或Ki-67)蛋白的表达量以每100个细胞中GLUT3(或Ki-67)蛋白阳性表达细胞数计算，并以均数±标准差((X)±S)方式表示，所有数据均为三次或以上重复试验结果。两组样本之间均数比较采用两独立样本t检验加以分析;多组均数间比较:方差齐同时整体比较采用One-way ANOVA，组间两两比较采用LSD法;方差不齐时整体比较采用welch检验，组间两两比较采用Tamhane's检验。GLUT3与Ki-67蛋白的表达量的相关性用Spearman相关方法加以分析。检验水准设为a=0.05。
　　结果:
　　1)随着胶质瘤病理级别的增高，样本中GLUT3的表达阳性率呈现逐级上升趋势分别为:Ⅰ级:0.900±0.909％，Ⅱ级:13.420±3.653％，Ⅲ级:64.280±8.094％，Ⅳ级:93.340±5.212％，经方差齐性检验，得levene统计量F=51.561，P＜0.001，说明组间方差不齐，采用welch法行整体分析，welch统计量为6016.194，P＜0.001，组间两两比较采用Tamhane's方法，各组间比较P值均小于0.001，差异具有统计学意义。
　　2)随着胶质瘤病理级别的增高，样本中Ki-67的表达阳性率呈现逐级上升趋势分别为:Ⅰ级:0.600±0.833％，Ⅱ级:11.140±4.291％，Ⅲ级:20.560±3.759％，Ⅳ级:31.500.±4.896％，经方差齐性检验，得levene统计量F=17.639，P＜0.001，说明组间方差不齐，采用welch法行整体分析，welch统计量为1106.416，P＜0.001，组间两两比较采用Tamhane's方法，各组间比较P值均小于0.001，差异具有统计学意义。
　　3)在肿瘤内部快速生长区中的GLUT3与Ki-67表达量均高于慢速生长区(GLUT3:93.340±5.212％/53.267±6.341％,t=-23.963,P＜0.001;Ki-67:32.333±6.562％/21.333±5.158％，t=-7.224，P＜0.001)，差异具有统计学意义。
　　4)样本中GLUT3的表达阳性率与Ki-67的表达阳性率呈呈正相关(spearman，rs=0.928，P＜0.001)。
　　结论:
　　1、 GLUT3在胶质瘤中出现异常表达，并且随着肿瘤级别增高而增高，在肿瘤内部生长快速区域表达量高于生长慢速区域，GLUT3表达分布与反映细胞增殖标志物Ki-67表达分布一致，说明GLUT3的表达与细胞增殖速度情况平行。
　　2、在胶质瘤中抑制GLUT3表达可以抑制胶质瘤细胞的增值速度，降低胶质瘤细胞的迁移侵袭能力，并促进肿瘤细胞的凋亡。
　　第二部分转录因子SP1参与胶质瘤中GLUT3异常表达的转录调控研究背景:
　　目的:
　　通过分析克隆人GLUT3基因的启动子，构建SP1结合位点野生型与突变型GLUT3基因启动子报告基因载体以及SP1真核表达载体，观察转染SP1真核表达载体上调SP1表达对GLUT3基因的表达以及GLUT3基因启动子活性的影响，再通过染色质免疫共沉淀技术观察在细胞内SP1与GLUT3基因启动子区的结合关系。
　　方法:
　　1)构建SP1真核表达载体pIRES2-ZsGreen1-SP1，培养U251细胞，分组分别转染pIRES2-ZsGreen1-SP1、空质粒pIRES2-ZsGreen1、用RT-PCR检测SP1、GLUT3、GAPDH的mRNA表达情况，分析SP1表达量及GLUT3表达量之间的关系。用免疫印迹方法检测SP1、GLUT3、GAPDH的蛋白表达情况，分析SP1表达量及GLUT3表达量之间的关系。
　　2)分析人GLUT3基因结构，扩增出GLUT3基因启动子区，并将其定向克隆到萤火虫荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中，构建出SP1结合位点野生型萤火虫荧光素酶报告基因载体pGL3-GLUT3-wt。将pGL3-GLUT3-wt以及空质粒pGL3-basic分别与内参质粒pRL TK共转染入胶质瘤细胞U251中，用双荧光素酶报告基因检测系统检测重组质粒pGL3-GLUT3-wt中插入片段的启动子活性。
　　3)分析GLUT3基因启动子区内转录因子SP1的潜在结合位点，用定点突变的方法构建SP1结合位点突变型萤火虫荧光素酶报告基因载体pGL3-GLUT3-mut。
　　4)培养胶质瘤细胞，分组转染pGL3-GLUT3-wt+pRL-TK+ pIRES2 ZsGreen1-SP1、pGL3-GLUT3-mut+pRL-TK+pIRES2 ZsGreen1 SP1以及pGL3-GLUT3-wt+pRL-TK+pIRES2-ZsGreen1培养后用双荧光素酶报告基因检测系统检测三组细胞的启动子活性，观察SP1结合位点在SP1上调GLUT3基因启动子活性中的作用。
　　5)培养胶质瘤细胞，甲醛固定，超声打碎DNA后，用SP1抗体做染色质免疫共沉淀，阳性对照为细胞裂解液Input，阴性对照为小鼠IgG代替SP1抗体，以各组获得DNA做模板，用SP1结合位点相关引物行荧光定量PCR，观察各组荧光强度，判断在肿瘤细胞内SP1是否结合于GLUT3基因的启动子上。
　　6)使用SPSS17.0分析，计量资料用均数±标准差((X)±s)表示，所有数据均为三次或三次以上重复试验所得结果。对所测结果进行正态性检验以及方差齐性检验，正态分布数据两组间均数比较采用独立样本t检验，多组均数间比较:方差齐同时整体比较采用One-way ANOVA，组间两两比较采用LSD法;方差不齐时整体比较采用welch检验，组间两两比较采用Tamhane's检验。检验水准设为α=0.05。
　　结果:
　　1)构建的重组质粒pGL3-GLUT3-wt、pGL3 GLUT3-mut，pIRES2-ZsGreen1-SP1经过测序，证实序列正确。
　　2)与转染空载体pIRES2-ZsGreen1组相比，转染构建的SP1真核表达载体pIRES2-ZsGreen1-SP1可以使胶质瘤细胞中SP1-mRNA与GLUT3-mRNA相对表达量上升（SP1-mRNA/GADPH-mRNA:0.573±0.0900/0.0844±0.00919，t=-16.204,P＜0.001; GLUT3-mRNA/GADPH-mRNA:0.513±0.0656/0.0392±0.0104,t=-21.401，P＜0.001); SP1-protein与GLUT3 protein相对表达量上升(SP1-protein/GADPH-protein:0.414±0.0573/0.212±0.0394，t=-8.585,P＜0.001; SP1-protein/GADPH-protein:0.337±0.0557/0.114±0.0400,t=-9.721，P＜0.001)。
　　3)与转染pGL3-basic+pRL-TK组相比，在转染pGL3-GLUT3-wt+pRL-TK组胶质瘤中相对荧光素酶活性明显增高(37.477±4.870/2.367±0.760，t=21.370，P＜0.001)。
　　4)结果提示GLUT3启动子区内SP1结合位是SP1上调GLUT3基因启动子活性的结构基础。
　　5)免疫共沉淀结果显示:以各组获得的DNA为模板，以SP1结合位点相关引物行荧光定量PCR，各组相对荧光强度比较，经方差齐性检验，得levene统计量F=7.560，P=0.003，说明组间方差不齐，经welch检验，得F=421.377，P＜0.001整体差异具有统计学意义。组间比较结果显示SP1抗体沉降组相对荧光强度低于Input组(236.206±56.688/459.069±44.985，Tamhane's，P＜0.001),而高于小鼠IgG组(236.206±56.688/23.278±11.148，Tamhane's，P＜0.001)，上述结果提示在胶质瘤细胞中SP1结合于GLUT3基因的启动子区。
　　结论:
　　转录因子SP1可以作用于GLUT3启动子区上SP1结合位点，并上调GLUT3启动子活性。

目录

摘要

第一章 GLUT3在胶质瘤中的异常表达及其意义

引言

第一节 胶质瘤演进过程中GLUT3表达量与Ki-67表达量之间的相关性

1．试剂与材料

2 实验方法

3．结果

4．讨论

第二节 抑制GLUT3表达对胶质瘤生长特性的影响

第一小节 GLUT3-RNA慢病毒干扰载体的构建与验证

第二小节 RNA干扰病毒载体介导的GLUT3沉默对胶质瘤生长特性的影响

第二章 SP1通过影响GLUT3启动子活性调节GLUT3基因表达

引言

第一节 在胶质瘤中SP1对GLUT3基因表达的影响

1．材料与试剂

2、方法

3．结果

4．讨论

第二节 在胶质瘤中SP1结合于GLUT3启动子上并激活GLUT3转录

1 材料与试剂

2 方法

3 结果

4．讨论

全文总结

后记与展望

综述：GLUT3及其表达调控机制研究进展

参考文献

缩略词表

在学期间所发表论文

致谢

声明

统计学审稿证明