益生菌抑制阪崎克罗诺杆菌致脑膜炎的初步研究

摘要

目的：
　　本研究的主要目的:评价鼠李糖乳杆菌(LGG)和分离自某健康足月新生儿粪便的脆弱拟杆菌(BF SK08)两种益生菌能否抑制阪崎克罗诺杆菌黏附和侵袭小肠上皮细胞(Caco-2)，从而预防和治疗克罗诺杆菌引起的菌血症和脑膜炎。(1)体外利用Caco-2细胞模型，检测阪崎克罗诺杆菌对Caco-2细胞的黏附、侵袭性及两种益生菌对Caco-2细胞的黏附性能。(2)采用竞争排斥置换法，探讨两种益生菌抑制阪崎克罗诺杆菌黏附侵袭Caco-2细胞的作用，确定益生菌黏附抑制阪崎克罗诺杆菌侵袭Caco-2细胞的方式。(3)运用westem blot验证两种益生菌对主要粘蛋白基因MUC-2表达的调节作用，益生菌能否拮抗阪崎克罗诺杆菌诱导的粘蛋白基因表达下降，发挥其拮抗致病菌黏附侵袭作用。(4)益生菌抑制阪崎克罗诺杆菌肠道血源性转移的新生大鼠模型建立及预防、治疗试验。通过以上研究，观察鼠李糖乳杆菌LGG和新型脆弱拟杆菌SK08两种益生菌能否抑制阪崎克罗诺杆菌引起的菌血症和脑膜炎，初步探讨益生菌抑制致病菌的黏附、侵袭和预防血行转移入脑是否与调节肠道粘液蛋白基因表达相关。
　　方法：
　　1、体外阪崎克罗诺杆菌黏附、侵袭实验
　　2、益生菌抑制阪崎克罗诺杆菌黏附、侵袭实验
　　3、益生菌诱导肠上皮细胞MUC-2基因表达
　　4、阪崎克罗诺杆菌肠道血源性转移的新生大鼠模型
　　结果：
　　1、阪崎克罗诺杆菌ATCC29544对Caco-2细胞具有黏附、侵袭性。其中以大肠杆菌E44（E coli K1株）作为阳性对照，DH5α为阴性对照，经3h黏附后，其黏附作用比阳性对照组E44小（相对黏附率为31.3％），比阴性对照组DH5α大（P＜0.05）;待细菌黏附3h后，加入庆大霉素进行侵袭实验检测，结果显示其侵袭作用与阳性对照组E44接近，比阴性对照组DH5α大（P＜0.05）。分别在1、3和5h时间点取培养板上细菌涂板，结果显示阪崎克罗诺杆菌在感染细胞3h后对细胞的黏附性和侵袭性最大，随着时间的推移，细菌的黏附能力有所下降(P＜0.05)。
　　2、益生菌（鼠李糖乳杆菌LGG和脆弱拟杆菌SK08）抑制阪崎克罗诺杆菌黏附、侵袭Caco-2细胞，且呈剂量依赖性。分别用不同浓度(106，107，108)的BF SK08和LGG进行抑制ATCC29544黏附、侵袭实验，结果显示随着BF SK08和LGG浓度的增加，阪崎克罗诺杆菌的相对侵袭率明显下降，说明侵入到Caco-2细胞中的致病菌明显减少，抑制作用明显(P＜0.05)。
　　采用竞争排斥置换实验，结果表明:与对照组相比，各实验组侵袭率均降低（P＜0.05），而竞争和排斥组抑制作用比置换组大，排斥组的抑制作用比竞争组大，统计学具有显著差异（P＜0.05），表明BF SK08和LGG两种益生菌对抑制致病菌阪崎克罗诺杆菌4侵袭Caco-2细胞具有一定作用，同时间接指导益生菌的预防效果强于治疗效果。
　　3、用WB法对益生菌拮抗致病菌黏附侵袭的机制进行了初步研究，提取各组细胞总蛋白，采用β-actin做内参，WB法检测益生菌和致病菌诱导肠上皮细胞Caco-2的Mucin基因的表达。结果显示加入益生菌的Caco-2细胞MUC-2基因明显上调，而未加入益生菌组的MUC-2基因表达则显著降低，共同加入益生菌和致病菌的组则基因表达无明显变化，说明益生菌诱导的MUC-2基因表达上调可能成为其拮抗致病菌的保护机制之一。MUC-2随着机体的病理性的改变而发生变化，会出现黏蛋白表达的异常包括黏蛋白的基因水平及其蛋白质水平的改变，硫基化程度的降低、糖基化和蛋白质高级结构与空间结构的改变，从而影响他们的保护功能的发挥，导致疾病的发生。本实验阐明MUC-2基因在人体结肠癌细胞中的生物学功能和进一步研究该基因与益生菌、致病菌之间存在一定关系。说明益生菌对致病菌黏附附侵袭肠上皮细胞的抑制作用离不开宿主本身携带的MUC-2基因的保护作用。
　　4、在阪崎克罗诺杆菌肠道血源性转移的新生大鼠中，同时设置预防组和治疗组，48 h后取肠道内容物、血液、脑脊液标本检测。结果显示，预防组和治疗组中，益生菌+致病菌组乳鼠肠道定植的阪崎克罗诺杆菌数量显著少于对照组（P＜0.05），未发生菌血症，脑脊液中也未检测到ATCC29544株。对照组灌胃致病菌(108CFU)后，预防组20只乳鼠中20只出现菌血症（＞105cfu/mL），14只脑脊液中出现ATCC29544株。治疗组20只乳鼠中20只出现菌血症（＞105cfu/mL），15只脑脊液中出现ATCC29544株。而益生菌预防组20只乳鼠中，LGG组有12只出现菌血症(＞105cfu/mL)，SK08组有11只出现菌血症(＞105cfu/mL)，混合益生菌组有11只出现菌血症（＞105cfu/mL），三组脑脊液中均没有出现菌ATCC29544株;益生菌治疗组20只乳鼠中，LGG组有14只出现菌血症(＞105 cfu/mL)，SK08组和混合益生菌组有12只出现菌血症（＞105cfu/mL），SK08组和混合益生菌组脑脊液中均没有出现ATCC29544株，而LGG组脑脊液中有1只出现ATCC29544株。结果表明:脆弱拟杆菌SK08和益生菌LGG可以抑制致病菌穿透肠屏障，从而减少了进入血脑屏障的细菌数量，用脆弱拟杆菌SK08和益生菌LGG预防和治疗小鼠脑膜炎具有一定效果。
　　结论：
　　1、脆弱拟杆菌SK08和益生菌LGG能黏附于肠上皮细胞，并能显著抑制阪崎克罗诺杆菌对肠上皮细胞的黏附、侵袭;
　　2、脆弱拟杆菌SK08和益生菌LGG可上调肠上皮细胞粘蛋白MUC-2基因表达，保护肠上皮细胞免受致病菌的损伤，这可能成为拮抗致病菌黏附、侵袭的保护机制之一;
　　3、新生乳鼠体内实验显示，脆弱拟杆菌BF SK08和益生菌LGG可以预防和治疗阪崎克罗诺杆菌引起的脑膜炎;
　　4、结合体内外实验结果，脆弱拟杆菌SK08和益生菌LGG对阪崎克罗诺杆菌引起的脑膜炎预防效果优于治疗效果。

目录

摘要

前言

总技术路线

第一部分 益生菌抑制阪崎克罗诺杆菌杆菌的黏附侵袭

1．1 材料

1．2 实验方法

1．3 实验结果

1．3 讨论

第二部分 益生菌抑制阪崎克罗诺杆菌致脑膜炎MUC-2机制

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 实验结果

2．4 讨论

第三部分 益生菌预防和治疗阪崎克罗诺杆菌引起的脑膜炎

3．1 实验材料

3．2 实验方法

3．3 结果

3．4 讨论

全文总结

参考文献

中英文缩略词表

致谢

声明